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低氧致肺动脉平滑肌细胞增殖及其作用机制初探 |
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合气流量使培养基PO2达6.6kPa(相 当于给整体动物吸入10%O2时肺泡和血液中氧浓度)并维持该低氧条件。
二、PASMC条件培养基(PASMC-CM)的制备［2］及PDGF生物活性的检测 ［3］：
将生长融合的PASMC用D-Hanks缓冲液洗3遍，每瓶加入5 mL无血清培养基，分别于常 氧和低氧条件下继续培养12 h、 24 h，分别收集常氧PASMC-CM及低氧12 h、 24 h的PASMC- CM。
用于检测PDGF生物活性的NIH3T3细胞(本所细胞室提供)分成4组：1%小牛血清标准对照 组、无血清培养基组、低氧12 h PASMC-CM组及低氧24 h PASMC-CM组。3T3细胞(×104) 接种于96孔细胞培养板中(100μL/孔)，37℃培养8 h后，换无血清DMEM培养基(100μL/孔) ， 静息24 h，再将以沸水变性15 min以去除其它蛋白和因子的SMC-CM加入培养板中(100μL/孔 )，培养48 h后弃上清，用结晶紫染色10 min，经流水冲洗干净后，加入1%SDS，震荡混匀后 用Bio-Tek酶标仪检测OD值，波长570 nm。以每100μL含1%小牛血清的DMEM液的促生长活 性为1单位(U)。
三、低氧的PASMC周期测定及［3H］-TdR掺入：
将培养的PASMC分为3组：常氧组、单纯低氧12 h组及低氧12 h+PDGF(30ng/mL（4） ）组。收集以上3组细胞(细胞数/组＞1×106)，以70%冷乙醇固定，离心沉淀去除固定 液后，加200μL 1mg/mL RNase A(Sigma)37℃ 处理30 min，再加入800μL碘化丙啶(Boehri ngermennheim)冰浴暗染30 min。PASMC悬液过滤后经FACS420流式细胞仪进行细胞周期分析 。
将PASMC以1×104种于96孔板中，待生长基本融合后，以无血清的DMEM培养基静息细胞 72 h，实验同上分3组(n=6)。低氧前向每孔中加入100μL含3.7×104 Bq/mL ［3 H］-TdR(北京原 子能研究所)的培养基，低氧完成后，弃去培养液，以0.25%胰酶消化细胞，使其脱落悬浮， 用多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，依次用PBS，三氯醋酸及无水乙醇冲洗后， 抽干，晾干滤膜，LS-9800型液闪计数仪计数(counts*min-1)。
四、PASMC PDGF-α及β受体的免疫组化分析：
参照美国ZYMED公司SP试剂盒的说明进行。经丙酮固定后的PASMC以3%H2O2温育10 min 以除去内源性过氧化酶的活性，PBS冲洗后，10%山羊血清封闭10 min。适当稀释度的抗PDGF -α及β受体的抗体(中山生物公司)4℃过夜后，用PBS洗三次(5 min/次)，再加生物素标记 的二抗，37℃孵育30 min，经辣根酶标记链霉卵白素结合后，DAB显色，封片后以计算机显 微图像处理系统对细胞的棕色阳性结果进行单位面积的灰度面积积分测定。实验分常氧对 照组及低氧12 h实验组两组进行PDGF-α及β两种受体的分析，数据测定选择20个细胞(n =20)。
五、统计处理：
细胞周期分析所得实验数据的统计学处理以X2检验进行。其余的实验结果均以均数 ±标准差(±s)表示，并用组间t检验进行统计学处理。
结 果
一、低氧促进PASMC的PDGF生物活性增高：
低氧12 h组PDGF活性显著高于常氧对照组，是对照组的1.38倍(P＜0.01)。低氧24 h 组的PDGF活性也高于常氧对照组(P＜0.05),但稍低于低氧12 h组。见表1。
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