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SOD对脑缺血 |
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［1］。在体外培养的星状胶质 细胞实验证实，氧自由基可抑制谷氨酸转运体的摄取功能［2］。在缺血及再灌注时 形成大量的氧自由基参与神经毒性损伤的形成。本工作用大鼠脑缺血-再灌注损伤模型，观 察超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)对谷氨酸转运体功能的影响，并同时检测了 脑组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及SOD活性的变化，以期探讨其机制。
材料和方法
一、实验材料：
［3 H］-L-谷氨酸(美国杜邦公司，152.07×1010 Bq/mmol)；SOD(河 北保定市生化营养源开发中心，4 000 U/mg)；MDA、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程 研究所)。高速冰冻离心机(日本Tomy 公 司出品，RS-20Ⅲ型)；液体闪烁计数仪(瑞典LKB公司出品，1209型)；分光光度计(上海分析 仪器厂出品，751型)。
二、实验方法：
1.动物模型复制：健康Wistar大鼠24只(250～350 g)，雌雄兼用，随机分为3组，每组8只。Ischemia-reperfu sion(I-R)组：20%的乌拉坦0.5 mL/100 g ip麻醉，行颈部手术，分离两侧颈总动脉，于甲 状软骨上缘右侧分离肌肉至枕骨腹面，先在枕骨嵴旁钻1小 孔，扩大为3 mm×2 mm大小的骨窗，暴露基底动脉，用特制无损伤的动脉夹夹闭上述3个动脉，脑电图变为一平 线，观察120 min，然后将3个动脉夹全部放开，继续观察30 min。SOD+I-R组于夹闭血管前10 min静脉推 注 SOD(680 U/100 g大鼠)，手术过程同I-R组。对照组实验过程基本同I-R组，但血管不夹闭， 。实验完毕后断头取脑，按自然分界分离皮层、海马、纹状体，液氮冷冻，-70℃冰箱保存 。
2.谷氨酸转运体膜颗粒制备：脑组织用10倍(W：V)的匀浆液(0.3 mol/L)甘露醇，1 mmol/L EDTA钠，pH7.4)匀浆后，以 6 000r/min离心10 min，取上清液，4℃，15 000 r/min离心20 min，混旋，依次加低张缓 冲液(1 mol/L Tris，0.5 mol/L EDTA钠，pH7.4)，悬浮缓冲液(100 mmol/L磷酸钠，5 mm oL/L Tris-SO4, 100 mmol/L MgSO4，0.5 mol/L EDTA钠，1%甘油，pH 7.4)，装载 缓冲液(0.1 mol/L 磷酸钾，1 mmoL/L MgSO4，pH6.8)，分别在4℃， 15 000 r/min离 心20 min，均取沉淀，最 后加装载缓冲液备用。
3.谷氨酸转运体功能测定：取突触膜颗粒20μL加入膜外液(0.15/L NaCl 180μL，0.25μL 3 H-L-谷氨酸)中， 置30℃水浴中反应10 min，用2 mL冰冷0.15/L NaCl终止反应，迅速倒在孔径为0.45 μm的滤 膜上定时(40 s)定量(24 mL)地用冰冷NaCl冲洗抽滤，滤膜烘干置于液闪瓶中，隔夜在液体 闪烁读数仪上测定。样本均做双管。膜颗粒的蛋白测定采用Lowry法。谷氨酸转运体的功能 表达为膜颗粒对谷氨酸的摄入量(nmol*min-1* mg-1 Pr)。
4.MDA含量、SOD活性测定：采用分光光度法测定MDA含量和SOD活性。MDA采用10%的匀浆 ，其含量单位为nmol/mg湿重；SOD采用1%的匀浆，活力单位为U/mL。
5.统计处理：实验结果以±s表示，组间比较采用方差分析。
结 果
一、SOD对谷氨酸转运体功能的影响：
I-R组皮层、海马、纹状体谷氨酸转运体的功能低于对照组(P＜0.01)；SOD+I-R组皮 层、海马、纹状体谷氨酸转运体功及SOD活性显著高于I-R组(P＜0.01，P＜0.0 5)，见表1。
表1 SOD对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织谷氨酸转运体功能的影响
Tab 1 The influence of SOD on glutamate transporter
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