|
P16基因与散发性食管癌的研究 |
| |
1 材料和方法
1.1 材料
本文所涉及的47例散发性食管癌的癌组织及癌旁组织均取自外科手术切除的肿瘤包块，并由南京铁道医学院附属医院病理科和江苏省肿瘤医院病理科提供并鉴定。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取
1.2.2 PCR扩增和套式PCR扩增
参考已有的文献报道，对第二外显子设计了一对外侧引物，为便于进一步进行SSCP操作和提高PCR产物直接测序的模板纯度，又设计了三对内侧引物(上海生工生物工程有限公司合成)。
反应总体积为50μl,其中10×反应缓冲液5μl,10pmol/μl引物各2μl,15mol/L MgCl2 2.7μl,2mmol/L dNTPs 5μl,基因组DNA 0.3μg,Taq酶2.5U(上海生工);反应条件为95℃ 30″,50℃ 30″,72℃ 45″,35个循环。
最后我们将扩增产物取8～10μl，经3％琼脂糖凝胶电泳，已知小分子Marker作标记，检测PCR产物的长度和纯度，观察有无缺失。
1.2.3 SSCP－银染检测
通过对实验条件的摸索，在对158、150bp的产物进行SSCP时，我们采用的是8％的聚丙烯酰胺凝胶;而对于140bp的产物，我们使用了不连续密度梯度聚丙烯酰胺凝胶，上层为8％，下层为12％，取得了较好的结果。
1.2.4 PCR产物直接银染测序
表1 PCR扩增及套式扩增的引物序列、片段大小
表2 P16基因变患者的一般情况
编号 性别 年龄 病理组织分型 浸润程度 淋巴结转移
1 男 60 溃疡型鳞癌II-III级 累及肌层 无
2 男 49 溃疡型鳞癌I-II级 浸润深肌层 无
3 男 51 髓质型小细胞未分化癌 累及全层 6-13转移
4 女 66 髓质型鳞癌I-II级 累及深肌层 无
5 男 64 溃疡型鳞癌II～III 累及深肌层 2/12转移
2 结 果
2.1 P16第二外显子的缺失
本实验用外侧引物对47例食管癌P16基因进行检测，发现其中2例食管癌存在纯合性缺失，为排除实验误差,对这些异常标本进行重复扩增并加入可获得294bp的一对内对照引物结果显示正常标本中均存在522bp带，而2例肿瘤标本的扩增产物中没有这条带（图2），为排除是由于引物两端改变造成522bp缺失的假象，我们又以基因组DNA为模板，分别用三对内侧引物进行扩增，结果依然是阴性，因此说明这些标本至少存在522bp的缺失。
图2 P16第二外显子PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
2.2 PCRSSCP筛查结果
(1)为了提高测序模板的纯度和SSCP的敏感性，以外侧引物的522bp扩增片段为模板，分别用三对内侧引物对各标本进行套式扩增可得158、150、140bp的片段。
(2)经PCRSSCP检测发现，在这些标本中所得的158和150bp片段中均无异常，而5例标本的140bp片段出现了异常（图3）。
图3 食管癌组织P16第二外显子140bp片段SSCP结果140bp的片段
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 广州汉族人群DYS19 DYS389 DYS390多态性及其单体型
下一个医学论文： 慢性酒精中毒与抑郁症状的临床分析
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文