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广州汉族人群DYS19 DYS389 DYS390多态性及其单体型 |
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按常规方法〔3〕，用酚、氯仿抽离，无水乙醇沉淀，最后溶于TE中。
1.3 引物序列
DYS19〔4〕
引物1 5′-CTA CTG AGT TTC TGT TAT AGT-3′
引物2 5′-ATG GCA TGT AGT GAG GACA-3′
DYS389Ⅰ/Ⅱ〔1〕
引物1 5′-CCA ACT CTC ATC TGT ATT ATC TAT-3′
引物2 5′-TCT TAT CTC CAC CCA CCA GA-3′
DYS390〔5〕
引物1 5′-TAT ATT TTA CAC ATT TTT GGG CC-3′
引物2 5′-TGA CAG TAA AAT GAA CAC ATT GC-3′
1.4 目标DNA片段扩增
以男性基因组DNA为模板，以女性基因组DNA及超纯水为模板的阴性对照，PCR扩增DYS19、DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS390。50μl反应体系含：100ng基因组DNA，一对引物各0.25μmol/L，dNTP各0.2mmol/L,2mmol/L MgCl2,50mml/L KCl,10mmol/L TrisHCl(pH8.3),0.5 U Taq DNA聚合酶。样品混匀后置PCR仪热循环：DYS19：94℃3min预变性，然后94℃30s，51℃30s，72℃30s，共30个周期；DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS390：94℃3min预变性，先94℃15s,58℃20s，72℃ 20s，5个周期，紧接94℃15s，54℃20s，72℃20s，30个周期。
1.5 扩增片段的电泳分离及银染显示
取3～5μl PCR产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上（20cm长×0.4mm厚），108V恒压电泳，14h后银染显带，照相并干胶保存结果。
1.6 等位基因命名
参照有关文献〔2，6〕，以核心序列重复次数命名各位点等位基因。
1.7 结果判断及数据处理
每次电泳加样时，同时加上已知碱基数大小的阶梯(ladder)样品和标准DNA 标记物(marker)，显带后主要依据阶梯分子量同时参考marker标记带来确定待测样品的表型。等位基因及单体型检出频率用直接计算法，与其他人群比较用χ2检验，基因多样性（gene diversity）按公式1－∑Pi2计算〔7〕。
2 结 果
2.1 DYS19、DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS390多态性检测
如图1，PAGE显示各基因座的多态性。实验中发现电泳图上标记物和阶梯分子量不完全一致，用微卫星荧光标记——半自动基因分型技术证实各等位基因分子量与阶梯分子量标准相一致，因此，主要参考阶梯分子量标准确定等位基因型。在111例调查对象中，DYS19基因座观察到5种等位基因，片段大小分别为186bp、190bp、194bp、198bp、202bp，DYS389Ⅰ基因座观察到4种等位基因，片段大小分别为243bp、247bp、251bp、255bp，DYS389Ⅱ观察到5种等位基因，片段大小分别为357bp、361bp、365bp、369bp、373bp，DYS390观察到5种等位基因，片段大小分别为203bp、207bp、211bp、215bp、219bp。
图1 广州汉族男性DYS19、DYS389I/II、DYS390分型检测部分电泳图（负极在上）
图中：①②③分别为DYS19、DYS389I/II、DYS390等位基因分型检测电泳图，L为各基因座等位基因阶梯（Ladder）,M为标记物（φX174DNA/HaeIII）,c表示女性对照，1～15为本研究所观察到的各基因座等位基因的代表性样号，其中1～5分别示DYS19基因座14、15、16、17、18型等位基因，6～10分别示DYS389I/II（上行为II型）基因座11/28、10/27、8/26、10/25、9/24单体型，11～15分别示DYS390基因座25、24、23、22、21型等位基因
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