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基因重组人碱性成纤维细胞生长因子的遗传毒性研究 |
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; Mutation; Teratogenesis genetoxicity
基因重组人碱性成纤维细胞生长因子（recombinant human basic Fibrorlast Growth Facter,rhbFGF)是一种促进神经、血管、肌肉皮肤等修复的生长因子，是重组DNA技术构建的多功能生物活性物质，具有良好的临床疗效〔1〕。为了确保人体用药的安全性，更好地应用于临床，了解是否具有潜在的遗传危害，对rh－bFGF进行了致突变与致畸作用的研究。
1 材料和方法
1.1 受试药物
rh－bFGF为白色粉末，纯度93.71％,批号96031，易溶于水，由广州微观生物工程公司和暨南大学生物工程研究所提供。
1.2 Ames试验
TA97、 TA98、 TA100和TA102菌株由美国Ames教授提供，采用标准平皿掺入法〔2〕在±S9mix条件下试验。rhbFGF配成0.1～500μg/皿6个剂量浓度，另设空白、辅料、溶剂、S9mix和阳性对照组，各剂量组均做3皿，重复试验2次。37℃培养48h，计数回变菌落数，结果判断按标准执行。
1.3 哺乳动物细胞染色体畸变试验
用中国仓鼠成纤维细胞(CHL,华西医科大学公共卫生学院提供),按Ishidate〔3〕方法，先测定半数抑制浓度(IC50),其IC50 值为53.0μg/ml。根据IC50 值，设rh-bFGF剂量为53.0、26.5、13.25、6.625μg/ml。以空白、辅料、溶剂、阳性(－S9mix MMC 0.2μg/ml，＋S9mix CP 60μg/ml)作对照。在±S9mix条件下进行试验(＋S9mix时药物作用6h后换DMEM一次),每组观察100个中期细胞，记录出现的各类染色体畸变，计算畸变率(％)。
1.4 小鼠骨髓细胞微核试验
用NIH雄性小鼠72只，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号24301042,体重22.5±1.5g,随机分组，每组6只。预试验rhbFGF最高剂量为0.034 mg/kg(由于未测得LD50,此值为人临床拟用量200倍),一次肌肉注射给药，在给药后12、24、36、48、72h取材，制片，观察不同时间点微核细胞率〔4〕。实验设rhbFGF 0.084、0.0085、0.00213、0.00053mg/kg b.w(相当于临床拟用量的3.118至200倍)。同时以空白、辅料、溶剂、阳性(CP-100 mg/kg)作对照，肌肉注射，给药后24h处死动物，制片，染色，以双盲法计数，每只观察1000个PCE及正常红细胞(NCE)。
1.5 小鼠致畸试验
用昆明种性成熟小鼠，雄性体重40.1±3.1g,雌性为34.5±3.2g，动物由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号24301041。随机取获阴栓的雌性小鼠，每组>25只。rh-bFGF 0.03264、0.00408和0.00051mg/kg b.w(相当于临床拟用量3至192倍）剂量组，于孕鼠6～15d，每天肌肉注射一次，连续10d。同时设空白‘辅料’溶剂和阳性（孕鼠d9～11d肌注CP10mg/kg b.w)对照。于妊娠第18天颈椎脱臼处死动物，测量胎鼠的身长和尾长，称体重，记录胎鼠的活胎、死胎、吸收胎及总着床数，检查各胎鼠外观、内脏和骨骼畸形，上述参数进行统计处理〔5,6〕。
2 结果和讨论
2.1 Ames试验
rh-bFGF各剂量组显示，在±S9mix条件下4个菌株的回变菌落数均未超过阴性对照2倍，表明在0.1～500μg/皿时对菌株无致突变性，结果见表1。
表1 rh-bFGF的Ames试验结果(±SD)*
剂量
(μg/ml) TA97 TA98 TA100 TA
-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9
500 145.56±8.04 145.11±9.06 47.33±6.57 52.00±6.67 182.88±10.00 209.00±16.63 254.33±18.90 255.00±17.54
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