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鹟科五种鸟线粒体DNA序列变化与亲缘关系的研究 |
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。12S rRNA是一个相当保守的序列，该序列作为系统分类指标，已建立了生物系统进化树（Edward），而鹟科鸟类的该项研究则是一个空白。本文通过对这一保守DNA序列变化的研究，来探讨科鸟类的分类问题, 试图直接从遗传物质DNA序列的变化中寻找它们之间的亲缘关系，从而寻找一个更适于鹟科鸟类系统分类的指标。
1 材料与方法
1.1 材料来源
(1)实验动物画眉（G.canorus）、红嘴相思鸟（L.lutea）、棕头鸦雀(P.webbiana)均购自南京夫子庙花鸟市场；乌鸫（T.merula）购自南京玄武湖动物园。 (2)PCR引物
所用扩增引物L1091/H1478为特异性扩增约400bp长的线粒体12S rRNA基因部分片段的通用引物，分别为：L1091(5′－AAAAAGCTTCAAACTGGGAT
TAGATACCCCACTAT－3′）；H1478(5′－TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT－3′)，（Kocherb et al.,1989）。由大连宝生物工程有限公司合成，用灭菌双蒸水配成10pmol/μl的溶剂。
1.2 DNA的制备
常规法提取总DNA，灭菌双蒸水溶解。
1.3 PCR扩增
PCR每60μl反应体积包括：37.2μl 双蒸H2O、8μl 10ⅹ缓冲液、4μl MgCl2、4.4μl dNTP（2mmol/L）、2μl 引物 L1091（34 pmol/L）、2μl引物H1478（34pmol/L）、0.4μl Taq DNA 聚合酶（2U）、2μl DNA（约200ng）。
扩增条件:95℃预变性4分钟后，进入循环：95℃变性，40秒；54℃退火，30秒；72℃延伸，1分；35次循环后，72℃延伸7分钟，4℃结束。
1.4 DNA银染测序
PCR产物用WizardTM纯化试剂盒（Promega公司）纯化，纯化产物采用银染测序法从正反两个方向进行序列测定，以保证结果的准确性。运用MEGA软件包进行序列聚类分析。
2 实验结果
2.1 序列测定结果
采用双参数法，用Clustalw程序(Thompson et al.,1994)对测定的序列进行对位排列，兼以手工校正。4种鸟12S rRNA该段序列对位排列共有412bp，其中P.webbianus（1）与P.webbianus（2）为棕头鸦雀的两个个体，结果如表1。
表1 5种鸟Mitochondrial 12S rRNA基因片段序列分析
2.2 结果处理
用系统发生软件包MEGA(Mocular Evolution Genetics Analysis)(Kumar等，1993)进行序列数据的分析处理。将灰冠弯嘴鹛的同源序列相比较，用人12S rRNA基因有关片段的序列作为外群比较，采用距离距阵法构建进化树，推演系统发生关系。在运用UPGMA法和NJ法重建系统树时，去除两两对位序列中的缺失(gaps)，同时应用自举检验（bootstrap test,Felsenstein,1985）估计系统树中结点的置信值(图1)。
图1 根据5种鸟12SrRNA基因同源序列构建分子系统树（图中结点值为BCL值，重复抽样次数：100）
3 讨 论
3.1 个体间的差异
我们取了棕头鸦雀两只个体进行序列测定，结果发现个体之间的差异较低，两只棕头鸦雀之间仅存在两个变异位点，远远小于其它动物12S rRNA序列的种间差异。尽管鸟类群体间的遗传多态性是常见的，但12S rRNA是一个高度保守的序列，其序列差异产生的原因可能为以下原因：一是线粒体DNA 12S rRNA为非蛋白质编码序列，因而沉默突变的概率较高；其二可能是实验误差所致。从我们所测的结果中发现该科鸟类个体间的差异在实验误差允许的范围内，并未呈现该序列种内多态性。物种进化过程是在种群中发生的，个体在发育成长至死亡的过程中，遗传物质的组成是不会起变化的，因此个体无进化而言。
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