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人胎盘蜕膜细胞5 |
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膜和来自母体的基蜕膜两部分组成。先前的研究已经证明，人胎盘绒毛膜自身能合成5-羟色胺(5-HT)［1］，又能表达5-HT的受体［2］，说明胎盘绒毛膜产生的5-HT可通过自分泌或旁分泌途径，对胎盘起局部调节作用。但是胎盘的基蜕膜能否产生5-HT及其受体未见报道。本实验用免疫组织化学及原位杂交方法对该问题进行了研究。
材料和方法
1. 试剂
兔抗5-HT多克隆抗体［3］及兔抗5-HT抗β型独特型抗体［4］均为本室自制。ABC药盒为武汉博士德生物工程公司产品。地高辛标记的5-HT1A受体寡核苷酸探针由我校解剖学教研室提供。碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体Fab段(Akp-Anti-Dig-AbFab)为德国宝灵曼公司产品。RNase A为华美公司产品。
2. 材料
胎龄为6～10周、16、24、40周人胎盘各5例，由唐都医院妇产科提供。
3. 标本制备
取小块新鲜的胎盘组织，用4℃生理盐水洗去血液，入Bouin液固定过夜，石蜡包埋，制成6μm厚的石蜡切片，将各周龄胎盘石蜡切片贴在同一载玻片上，在37℃温箱烘干备用。另取小块胎盘组织经Bouin液固定后，入20%蔗糖液，待组织块下沉后，用恒冷箱切片机切成20μm厚的冰冻切片，将各周龄胎盘的冰冻切片贴在同一涂有明胶的载玻片上，置43℃温箱烘干24h备用。
4. 免疫组织化学反应程序
石蜡切片脱蜡水化后，入甲醇-H2O2孵育20min，除去内源性过氧化物酶，然而按ABC法进行5-HT、5-HT受体免疫组织化学反应。第一抗体分别为5-HT抗体(1∶5 000稀释)和5-HT抗独特型抗体(1∶200稀释)，在4℃冰箱内孵育24h，生物素化羊抗兔IgG抗体(1∶100稀释)室温孵育1h，ABC复合物(1∶100稀释)室温下孵育30min。用正常兔血清分别取代第一抗体作阴性对照。
5. 原位杂交程序
胎盘组织冰冻切片在43℃温箱烘干后，依次入0.1mol/L PBS漂洗5min，0.1mol/L甘氨酸5min，0.3% Triton X-100 15 min，经蛋白酶K(1mg/L)孵育30min后，入4%多聚甲醛(用0.1mol/L PBS配制)5min，0.1mol/L PBS 5min ×2，入0.5%乙酸酐(用0.1mol/L三乙醇胺配制)10min，最后入2×SSC进行预处理10min后，滴加杂交液(含地高辛标记的5-HT1A受体寡核苷酸探针0.5μg/L，于43℃恒温箱中杂交12～16h。杂交后切片入4×SSC 20min，再入RNase A溶液(20mg/L)30min，以消化未杂交的探针。切片再依次经1×SSC，0.5×SSC和0.05×SSC各15min，滴加AkP-Anti-Dig-AbFab(1∶500稀释)，置湿盒内于室温孵育5h，然后经0.05mol/L PBS洗5min×4，再经TSM1和TSM2液各10min，最后滴加NBT/BCIP混和液室温显色3～6h，入0.05mol/L PBS 5min终止显色反应。切片在37℃温箱烘干后，二甲苯透明，树胶封固。阴性对照试验分别用不含探针的杂交缓冲液取代含探针的杂交液，及用正常羊血清取代AkP-Anti-Dig-AbFab进行孵育。
6. 图像分析方法
用Q-500图像分析系统(美国Leica公司)对不同发育阶段胎盘蜕膜细胞的5-HT及其受体免疫反应产物的相对含量进行测定，在光镜下(×100)每例随机取样测5个视野，10个单位面积，每组共测50个单位面积，计算出每个单位面积的5-HT及其受体免疫反应产物的相对含量，用组间t检验方法作统计学处理。
结果
1. 免疫组织化学反应
5-HT及5-HT受体免疫反应性的细胞呈深棕色，背底呈浅黄色或不着色。对照为阴性反应。被检各周龄的胎盘均可观察到5-HT及5-HT受体免疫反应性细胞，细胞为梭形、卵圆形或多边形，成群分布。两种免疫反应阳性物质均分布于细胞质内，胞核为阴性(图1，2)。妊娠等6周的胎盘，5-HT及其受体免疫反应性的蜕膜细胞稀少，着色也较淡，随着妊娠周龄的增加，5-HT及其受体免疫反应性的蜕膜细胞数逐渐增加，着色也逐渐增强。
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