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人食管癌细胞核基质的研究 |
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sented in nuclear matrix proteins of two cell lines. Conclusion There are esophageal carcinoma cell specific nuclear matrix proteins and the nuclear matrix-lamina-intermediate filament forms a continuous system which plays an important role in the maintenance of the nuclear integrity and cellular function.
Key words：Nuclear matrix; Esophageal carcinoma cells; Morphology; Electrophoresis▲
核基质是细胞核内非染色质蛋白的纤维网架，真核细胞在用非离子去垢剂、核酸酶和高盐溶液处理后，核内残留成分的98%以上为蛋白质，此外还有少量RNA和DNA。核基质构成细胞核的三维网架体系，在DNA复制、特异基因转录、RNA修饰、染色质包装、染色体形成和松解以及细胞分裂和分化等细胞生命活动中起重要作用［1］。在肿瘤形成中，特殊基因的活化和表达与核基质蛋白组成的变化息息相关。有研究表明，人体肿瘤的发生、发展过程伴随着核基质蛋白的特异性改变［2～5］，探讨肿瘤细胞核基质蛋白的改变，不仅有利于寻找肿瘤标志物，也有助于阐明肿瘤活性基因表达调控机理。本研究应用细胞的选择性抽提二硬脂酸二甘酯(diethylene glycol distearate，DGD)包埋-去包埋剂电镜制样、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向电泳和免疫印迹分析，观察比较了人食管癌细胞株EC1和EC18的核基质。
材料和方法
1. 细胞及其培养
人食管癌细胞株EC1和EC18由香港中文大学分别从食管低分化鳞癌和高分化鳞癌手术标本建立。本实验所用EC1是传代至63～67代之间的细胞，EC18是传代至69～72代之间的细胞。两种细胞均培养于含10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100mg/L链霉素的RPMI 1640中，置5% CO2，37℃培养箱内，传代时用胰蛋白酶消化。
2. 核基质抽提
参照Yang［6］的方法，收获培养的EC1、EC18细胞经DPBS洗涤后，再置于CSK缓冲液(100mmol/L KCl,3mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,1.2mmol/L苯甲基磺酰氟，10mmol/L PIPES pH6.8,300mmol/L Sucrose,0.5% Triton X-100,4mmol/L 氧钒核苷复合物)中4℃处理15min，离心沉淀后，用RSB缓冲液(42.5mmol/L Tris-HCl,8.5mmol/L NaCl,2.6mmol/L MgCl2,1.2mmol/L苯甲基磺酰氟，1%Tween 40,0.5%脱氧胆酸钠，2mmol/L氧钒核苷复合物)悬浮沉淀细胞，4℃作用10min，离心后再用DB溶液(基本成分与CSK缓冲液相同，仅以50mmol/L NaCl代替100mml/L KCl)悬浮细胞并加入200mg/L DNaseⅠ室温消化30min，然后加入冷的2mmol/L(NH4)2SO4，使其终浓度为0.25mmol/L,取离心淀淀物，用于电镜样品制备。
3. DGD包埋-去包埋剂电镜样品制备
抽提后的标本用2.5%戊二醛-CSK溶液4℃固定1h，1%锇酸固定30min，系列乙醇脱水，正丁醇过渡，DGD浸透包埋，切片，厚0.2μm，置镍网上干燥，在室温正丁醇中溶去包埋剂，然后由乙醇经系列Freon 13置换到纯Freon 13中，临界点干燥后，不经染色，直接用HITACHI H-7100型电子显微镜75kV观察。
4. SDS-PAGE及双向电泳分析
肿瘤细胞经选择性抽提后制备的样品溶解在蛋白溶解缓冲液中(8mol/L尿素，20mmol/L吗啉乙烷磺酸，1mmol/L EGTA,0.1mmol/L MgCl2,1mmol/L苯甲基磺酰氟，1% β-疏基乙醇)，通过透析缓冲液(150mmol/L KCl,25mmol/L 盐酸咪唑，5mmol/L MgCl2,2mmol/L DDT,0.125mmol/L EGTA,0.2mmol/L苯甲基磺酰氟)4℃透析过夜和低温超速离心去除中间纤维，获得的核基质蛋白溶解于样品缓冲液中，按常规方法进行上一页 [1] [2] [3] 下一页
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