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p53 mRNA,mp53 mRNA and Rb mRNA were localized in the cytoplasm of HXO-Rb44 cells.The p16-IR,p21WAF1-IR and pRb-IR were predominently localized in the nuclei.In the dot blot the relative scanning value of p16INK4 mRNA,p21waf1 mRNA,wp53 mRNA,Rb mRNA and p16-IR,p21WAF1-IR,pRb-IR of the exprimental groups(EG,treated with 8-Br-cAMP)was higher than that in respective control groups(CG,treated with no 8-Br-cAMP),P＜0.05-0.01.However,the scanning value of the mp53 mRNA,PCNA-IR,cdk2-IR and cdk4-IR of EG was lower than that in respective control groups,P＜0.05-0.01. Conclusions (1)8-Br-cAMP could inhibit human HXO-Rb44 cell growth and proliferation.(2)8-Br-cAMP could up-regulate antioncogene expression,including mRNA expression of p16INK4,p21waf1,wp53 and Rb and protein expression of p16,p21WAFl and pRb.(3)8-Br-cAMP could down-regulate expression of mp53 mRNA,PCNA-IR,cdk2-IR and cdk4-IR expression.(4)The results suggest that 8-Br-cAMP may decrease human HXO-Rb44 cell growth via inhibition of cell cycle progressing related gene expression.
Key words：Retinoblastoma cell; Antioncogene; In situ hybridization; CDKs▲
近年研究表明，cAMP受体可分为RⅠ及RⅡ两型，此两型通过基因调控，一般在细胞中呈正负调节因子调控细胞的生长和分化。RⅠ型促进细胞生长，抑制细胞成熟及分化，而RⅡ型则抑制细胞生长而促进细胞早期分化。关于cAMPRⅡα亚型(α亚型不具组织特异性)的选择性结合位点类似物主要有8-Cl-cAMP和8-Br-cAMP，两者效应相似［1］，前者作用更强，后者无毒性，国外多应用8-Br-cAMP于研究工作。人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞为缺失Rb基因的细胞系，恶性肿瘤的发生主要由于一方面原癌基因激活为癌基因，另一方面则可由于抑癌基因的失活。我们研究8-Br-cAMP对人视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)HXO-Rb44细胞的有关抑癌基因表达的效应而探讨其对细胞生长的关系，至今未见有关这方面的报道。
材料和方法
1. HXO-Rb44细胞标本的制备
将体外培养的人HXO-Rb44细胞系(湖南医科大学赠)等分为两组，1组加终浓度为2×10-5mol/L 8-Br-cAMP(Sigma)的实验组(EG)，另1组为不加8-Br-cAMP的对照组(CG)。培养24h后，最后调整细胞浓度为1×107个/ml，分别将两组的细胞悬液滴于硝酸纤维素膜(NCM)和玻片上制备两种标本。
2. NCM完整细胞mRNA斑点印迹
参照“实用非放射性分子生物学实验技术”［2］介绍的方法，主要步骤依次为：滴膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的RNA，用RNA变性液在NCM下渗透变性，真空烤膜，打孔取样放入96孔板(COSTAR)内(EG和CG各9～10个样本)，预杂交后，分别加各种生物素标记的cDNA探针，包括p16INK4、p21waf1、野生型(w)p53、突变型(m)p53和Rb的cDNA探针(各探针的灵敏度达1.0～0.1pg)，进行杂交，0.上一页 [1] [2] [3] 下一页
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