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斑蝥素及去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的细胞学研究 |
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d the nuclear envelope with compacting cytoplasm,normal or slightly expanded endoplasmic reticulum,which presented typical morphology of apoptosis.FACS analysis of DNA profiles and cell morphological studies indicated that the apoptosis was related to tumor cell G2/M phase blocking. Conclusions Apoptosis was induced by CA and NCTD in K562 cells,most of which initiated in mitosis phase,others in interphase.
Key words：Cantharidin; Norcantharidin; Apoptosis; K562 cell; Cell cycle▲
斑蝥为常用中药之一，具有攻坚蚀疮、破血散结的功能。斑蝥体内所含斑蝥素(cantharidin,CA)已证明有抗肿瘤活性。临床上，CA能够缓解原发性肝癌患者病情，提高1年生存率。动物实验表明，CA可以刺激骨髓产生白细胞，使外周血中白细胞数升高(升白)。但是CA有剧烈毒性，小鼠急性LD50(ip)为1.0mg/kg。临床应用CA有强烈的泌尿系刺激作用，使患者难以坚持治疗。而且由于CA产生泌尿系刺激剂量低于其升白剂量，临床应用剂量下不能表现其升白作用。去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)由呋喃及顺丁烯二酸酐加成、氢化而得，与CA相比，缺少1，2位的两个甲基，立体构型相同，其毒性显著降低，小鼠急性LD50(ip)为12.5mg/kg。临床应用NCTD治疗多种癌症，以原发性肝癌为主，毒副作用大大降低，升白效果显著［1，2］。NCTD能够诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡［3］。我们研究了CA及NCTD诱导K562细胞凋亡的细胞学变化特点。
材料和方法
1. 细胞系及培养条件
人红白血病K562细胞(中日友好临床医学研究所细胞室冻存)接种于含10%小牛血清、105IU/L青霉素及105IU/L链霉素的RPMI-1640培养液中，在37℃、含5%CO2的培养箱内培养传代。加药均在细胞对数生长期内进行。
2. 药品与试剂
CA用丙酮自南方大斑蝥(Mylabris phalerata Pallas.)的干燥虫体中提取、精制而得［4，5］。NCTD由呋喃及顺丁烯二酸酐经加成、氢化得到［6］，(北京第四制药厂王广生教授惠赠)。两药均在RPMI-1640内溶解，抽滤灭菌，-20℃保存。RNase A和Proteinase K(E Merck)按分子克隆操作指南［7］分别配成10g/L和20g/L，-20℃存放。Nonidet P-40(NP-40)：Fluka产品。
3. 细胞的增殖抑制曲线
参照文献［8］，取对数生长期的细胞用生长培养基配成1×108/L悬液，在50ml培养瓶中接种10ml。加入待试药物100μl置含5%CO2的37℃培养箱中培养，在培养即刻及培养后1、2、3d从对照组及加药处理组各取样40μl，加0.4% Trypan blue 10μl，混匀，反应5min后，血球计数板计数活细胞，15min内计完，每个样品均设3个平行组，结果取3组的平均值，最后以K562细胞生长抑制率对时间作图。
细胞生长抑制率=
4. 细胞DNA片断的提取及琼脂糖凝胶电泳
参照文献［9］收集DNA片段，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，恒压33V；紫外透射仪上观察并摄影。
5. 细胞形态学观察
5.1 生活细胞的形态学：在日本Olympus IMT-2型倒置显微镜(带保温装置)下对活细胞进行动态观察。
5.2 Wright-Giemsa染液染色观察细胞及核的形态：细胞推片或离心涂片，固定后，Wright-Giemsa染液染色，光镜下观察。
5.3 超微结构观察：细胞经常规2.5%戊二醛、1%锇酸双固定，逐级浓度酒精脱水，Spury Resin树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅-醋酸双氧铀电子染色，JEM-1200EX透射电镜下观察。
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