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三磷酸腺苷诱导人白血病细胞U937凋亡的电镜观察 |
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membrane formed apoptotic bodies which is shed from membrane surface into intercellular medium;(4) Apoptotic bodies were nigrosine staining negtive. Conclusion ATP inhibited the proliferation and induced the apoptosis of U937 cells (human histocytic lymphoma).It blocked U937 cells in G1 phase and formed apoptotic bodies.It was indicated that ATP would be a effective promoter of U937 cells apoptosis.
Key words：ATP; U937 cells; Apoptosis▲
细胞凋亡是生理性死亡的主要方式，在机体的生长发育及维持自身稳定中起重要作用，细胞增殖和细胞凋亡的异常是肿瘤发生的重要因素，放射线、高热、抗癌药物等能引起肿瘤细胞的凋亡［1］，抗癌药物的疗效与细胞的凋亡有关［2，3］，三磷酸腺苷已是临床上用于治疗心血管疾病的辅助药，我们曾报道过它对癌细胞增殖的抑制和诱导分化作用［4～7］，本实验观察到它对人白血病细胞有促进凋亡及凋亡小体形成的作用，这对临床开辟ATP治疗癌症及阐明凋亡细胞及凋亡小体的生物学意义都有一定价值。
材料和方法
1.细胞的培养和处理
人白血病细胞U937(human histocytic lymphoma)接种于含12%胎牛血清的RPMI1640培养液内，置于5%CO2孵育箱内(37℃)，实验前按不同要求处理细胞。
2.细胞增殖抑制实验
U937细胞(104/ml)接种于24孔板的培养孔内，同日或隔日加入0.23g/L ATP为实验组，不加ATP的为对照组，每日换液，每日用白细胞计数器计数细胞，该实验重复3次，取3次均值，绘制生长曲线并计算抑制率。
3.流式细胞分析仪检测细胞周期分布和凋亡峰
将接种于培养瓶内的两组细胞(105／ml)依ATP处理不同时间(6、12、24、48h)分别制备两组细胞悬浮液，离心5min后(1 000r／min)固定于75%酒精内，置于4℃冰箱内贮存，待进行流式分析仪分析前，经PBS洗涤2次去上清，再各用200ul PBS制成细胞悬液，置于37℃水浴中30min，然后经PBS洗2次后加入RNase(1g/L)和PI(50mg/L)于细胞团中进行DNA染色后，在EPICS-PROFILE Ⅱ细胞分析仪上检测ATP对U937细胞的周期时相分布的影响及促凋亡作用。
4.透射电镜样品制备
分别把两组细胞悬浮离心5min后(1 000r／min)去上清，把沉淀细胞固定于1%戊二醛／PBS内，放置4℃冰箱内2h，梯度酒精脱水，Epon812包埋，LKB5型超薄切片机切片，铀铅双染。透射电镜观察、摄片。
5.苏木精-伊红(HE)染色检测凋亡小体
把接种于培养瓶的细胞于ATP处理48h时，悬浮离心5min后去上清，固定于冰醋酸甲醇(3∶1)混合液中30min，干燥后用苏木精-伊红染色，脱水透明封片后在光学显微镜下检测凋亡小体的形成过程。
6.扫描电镜样品制备
分别把两组细胞盖片固定于1%戊二醛／PBS 30min，换入PBS(-)洗2次，1%锇酸固定30min，梯度酒精脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥器干燥，喷金，扫描电镜观察。
7.苯胺黑染色检测凋亡小体的着色情况
把两组细胞分别滴(5滴)在载玻片上，并分别滴入0.1%苯胺黑(黑色素，nigrosine)／任格液(2滴)待5min后，镜下检查100个U937细胞及分离出的凋亡小体，其中死亡的细胞和凋亡小体，由于膜的通透性增加势必染成黑色，若细胞和凋亡小体不着色，则表明细胞和凋亡小体是有生命的。
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