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肿瘤组织中端粒酶活性的研究 |
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盒；(2)PCR反应：取25μl PCR反应液，加入2μl(约2～15μg)总蛋白提取液，加水至50μl，所有均在冰上操作。PCR循环如下：a.25℃20min，端粒酶引物TS延伸；b.94℃预变性5min，94℃30s→50℃30s→72℃90s 30个循环，72℃延伸10min。
2.1.3 杂交和ELISA：(以下操作均在室温)(1)取20μl变性液，加入PCR扩增产物5μl，室温孵育10min。加入225μl杂交液充分混匀；(2)将杂交混合液按100μl／孔，加到已包被好的微量免疫板上，粘性泊纸覆盖，防止蒸发。37℃，300r/min孵育2min。弃杂交液，加250μl洗液，洗3次，每次洗1.5min；(3)弃洗液，加抗-地高辛-过氧化物酶工作液100μl／孔，300r/min振荡30min，洗5次；(4)加底物TMB100μl／孔，泊纸覆盖300r/min振荡，室温孵育20min；(5)加入终止液100μl.测450nm和690nm吸收值，测定须在加入终止液后30min内完成。
2.1.4 结果计算：(1)阳性对照：试剂盒内提供，如：A450-A690＞1.5为阳性合格；(2)阴性对照；用加热或RNase消化提取液作阴性对照，如A450-A690<0.25阴性合格；(3)样本：A450-A690-A阴>0.2为阳性，否则为阴性；
2.2 PCR银染方法检测端粒酶活性
2.2.1 总蛋白提取(同前)
2.2.2 PCR扩增：(1)引物：合成的端粒酶RNA模板逆转录引物TS：5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’；CX 5’-CCCTTACCCTTAC-CCTTACCCTAA3’；(2)TRAP反应：a.参照Kim每50μlTRAP反应液含20 mmol/L Tris-HCL，1.5mmol/L MgCl2，63mmol/L KCl，0.005% Tween-20，1mmol/L EGTA,50μmol/L dNTP,1μgT4 g32蛋白，0.1g/L牛血清白蛋白，0.1μgTS引物,2μ Taq酶，2μl细胞提取液，0.2～0.4μl α-32p dGTP／dCTA 10IU Ci／μl的方法改进;b.25℃20min，端粒酶引物TS延伸后，加入0.1μg CX引物；c.94℃预变性5min。PCR循环：94℃30s→50℃30s→72℃90s30个循环，72℃延伸10min。
2.2.3 电泳：12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，加入10μl PCR产物，2μl 6×Loading buffer。150V恒压电泳4h，电泳缓冲液为1×TBE。
2.2.4 银染：(1)固定：电泳胶在10%冰乙酸300ml中振荡固定10min，洗1次；(2)银染：0.2%AgNO3 300ml加入0.5ml 37%甲醛，染色30min，洗1次；(3)显色：3% Na2CO3 300ml，加入37%甲醛0.5ml，20g/L硫代硫酸钠300μl，显色至清晰带条；(4)终止：10%冰乙酸300ml，终止显色；
结 果
用TRAP-ELISA端粒酶活性检测法分析了45例手术标本，2个细胞系，其结果见表1。用我们自己研究建立的非同位素TRAP-电泳-银染的方法，对15例标本进行了与TRAP-ELISA法对比检测，两种检测方法的结果一致。
表1 端粒酶活性检测结果
Table 1 Results of telomeras activity
标本来源
samples 例数
case No 端粒酶阳性
positive 阳性率
positive rate
脑瘤(brain tumors) 17 12 70.59%
肠癌(intestina cancer) 13 11 84.62%
食管癌(esophagesl cancer) 10 9 90.00%
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