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百日咳毒素S1亚单位缺失分子的构建及其在重组杆状病毒中的表达 |
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> 百日咳是一种严重的呼吸系统疾病，在婴儿中具有很高的发病率及死亡率，其病原菌(百日咳杆菌)能产生包括百日咳毒素(PT)在内的十多种毒性因子，其中PT既是主要毒性因子，又是预防百日咳的主要保护性抗原。PT是一个具有A-B结构的六聚体蛋白，A结构即S1亚单位，PT的毒性(ADP-核糖转移酶活性)和主要保护性抗原决定簇就位于该亚单位上［1］。传统的百日咳疫苗是用化学方法灭活的全细胞疫苗，它具有较广泛的毒副作用。Burnette等应用定点诱变术构建了一种S1变异子(R9→K)，其酶活性丧失，却仍保持主要保护性决定簇［2］。于康震等在此基础上对天然及变异S1亚单位编码基因进行了一系列分子修饰，并使用重组杆状病毒(rBV)技术高水平表达了这些亚单位［3］。但研究发现，S1亚单位既使经流感病毒HA信号序列修饰(S1/3-4)，仍不能由昆虫细胞分泌［4］。应用计算机辅助分析发现在S1/3-4亚单位羧基端有2个主要疏水区，分别包括19(201～219)和14(239～252)个疏水性氨基酸。其长度与强度足以发挥嵌膜作用。为探
明羧基端疏水区对其分泌性的影响，本研究中我们构建了6种不同信号序列修饰、缺失羧基端疏水区的S1亚单位编码基因，并应用rBV系统成功地高水平表达了这些缺失分子，为其分泌性及免疫学特性的进一步鉴定打下了基础。
1 材料与方法
1.1 细胞系、病毒及质粒 昆虫细胞系Sf9及High5由美国加利福尼亚大学兽医学院国际热带病原分子生物学实验室提供。培养基为完全Grace s培养基添加10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素、2.5 μg/ml二性霉素B，27℃传代培养。核多角体病毒(AcNPV)DNA和杆状病毒转移载体质粒pVL1392购自Invitrogen公司。
1.2 主要试剂 限制性内切酶、聚合酶、连接酶等购自Boehringer Mannheim公司；PT购自Sigma公司；抗S1亚单位的单克隆抗体1B7［5］由Sato博士惠赠，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自中国军事医学科学院。
1.3 缺失羧基端疏水区S1亚单位编码基因的构建 分别以6种全长S1亚单位编码基因［含细菌信号序列的天然(S1/1)及变异(S1/1-4)、不含信号序列的天然(S1/2)及变异(S1/2-4)、携带流感病毒信号序列的天然(S1/3)及变异(S1/3-4)S1亚单位编码基因］［3］为模板，应用聚合酶链反应(PCR)技术，扩增了相应的不含羧基端疏水区的S1亚单位编码基因(分别命名为tS1/1,tS1/1-4,tS1/2,tS1/2-4,tS1/3,tS1/3-4)。所用PCR引物为：P1 5’＞CCG GAT TAT TCA TAC CGT CCC ACC＜3’，P2 5’＞TTA GAT CGA CGC TAC GGA CCT TCG CGA＜3’。
1.4 重组转移载体的构建 将6种PCR产物和转移载体pVL1392分别用相应的限制性内切酶消化后连接，转化大肠杆菌DH5α。用原位杂交及酶切分析筛选和鉴定重组质粒(pVLS1)。
1.5 重组杆状病毒的构建 采用线性转染技术(Invitrogen)［3］。以线性AcNPV DNA与pVLS1共转染昆虫细胞Sf9，经蚀斑筛选、纯化技术获得重组病毒。
1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western blot)分析 以6种rBV感染High5细胞单层(感染量MOI=10)，在感染后72 h收集细胞，直接溶于加样缓冲液中，分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为5%。以PT和AcNPV感染的细胞作对照。SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝R-250染色。免疫印迹参照文献［6］进行。以抗S1亚单位的单克隆抗体1B7及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG用于免疫学检测。
1.7 tS1亚单位表达水平及信号肽处理 按以前报道的方法测定每万个昆虫细胞中tS1亚单位的表达量和分析tS1亚单位信号肽在昆虫细胞中的处理效率［3］。
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