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人重组TFAR19蛋白对白血病细胞株HL |
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g effect of the TFAR19 protein. Conclusion: TFAR19 protein can directly enter HL-60 cells and exhibits an apoptosis-accelerating effect. Caspase-3 as an apoptosis effector may involve the effect of TFAR19. Key words:TFAR19 Apoptosis HL-60 cells Caspase-3▲
凋亡(Apoptosis)或程序化死亡是基因控制的细胞自我毁灭的过程,它在机体的发育和内稳定的维持中起着至关重要的作用[1,2]。由于细胞凋亡为多阶段,多系统,多基因参与的复杂过程,目前对其参与的全部基因尚未了解清楚。本研究组在对红白血病细胞株TF-1细胞的凋亡相关基因研究中,曾经成功地克隆了一个新的凋亡相关基因的全长cDNA(GenBank登记号为AF014955),将其构建的真核表达载体转染TF-1等细胞后,可加速这些细胞的凋亡,证明其为凋亡相关基因并命名为TFAR19(TF-1cell apoptosis related gene),同时还证明其定位于细胞核[3,4]。为进一步研究在蛋白质水平上TFAR19的作用,本工作重点探讨了重组TFAR19蛋白对白血病细胞的影响,并对其作用机理进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 试剂 ApoAlertTM Apoptosis Kit, Caspase-3抑制剂DEVD-fmk购自Clontech公司。具有诱导凋亡效应的蛋白激酶抑制剂Staurosporin购自Sigma公司。 1.1.2 菌种与细胞株 质粒:pMTY4-TFAR19,本室构建[3,4],含PL启动子,可在大肠杆菌表达MS2-凝血酶接头-TFAR19融合蛋白,分子量约为25 kD,经凝血酶切割后可收获非融合的重组TFAR19蛋白,分子量约为14 kD。宿主菌:大肠杆菌pop2136(CI857温度敏感)为C600衍生菌,编码温度敏感λ阻遏蛋白,由Raiband博士惠赠。细胞株:HL-60细胞株为人早幼粒细胞系,本室保存。 1.2 方法 1.2.1 重组TFAR19蛋白在原核细胞中表达和纯化 pMTY4-TFAR19可在pop2136菌株中以包涵体的形式经42℃诱导表达融合蛋白,收集细菌经超声裂解洗涤,制备成包涵体,在8 mol/L尿素,20 mmol/L Glysine-NaOH(pH10.0)中,37℃变性30 min,将变性液稀释至1 mol/L尿素复性,以HAc/NaAc(pH4.5)调复性液pH为8.5,凝血酶27℃孵育过夜,利用DEAE离子交换层析进行蛋白质纯化,20 mmol/L Glysine-NaOH/HAc NaAc(pH8.5)条件下上样,50 mmol/L Tris-HCl(pH8.9) NaCl梯度洗脱,在0.06 mol/L NaCl盐浓度洗脱下目的蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达和纯度。 1.2.2 重组TFAR19蛋白对HL-60细胞凋亡的影响 HL-60细胞在含10%小牛血清RPMI 1640培养液中培养2 d后,离心收集细胞,用无血清1640洗涤细胞2次,以无血清1640调整细胞浓度为1.2×106 ml-1,放入24孔培养板中,实验孔分别加入纯化的TFAR19蛋白25、20、15、10、5 μg,对照孔加入与其实验孔等体积的PBS,放入37℃培养箱5%CO2,16 h后收获,对凋亡细胞进行检测。 1.2.3 细胞凋亡后DNA片段化的检测 收集TFAR19蛋白作用后的HL-60细胞,加入裂解液及蛋白酶K,50℃,1 h,再加入RNAse 50℃,1 h,加入TE缓冲液,70℃条件下加入低熔点的1%Agarose,通过1.3%Agarose DNA电泳,观察凋亡细胞梯形条带的形成。 1.2.4 凋亡细胞DNA含量的流式细胞仪分析 TFAR19蛋白处理过的HL-60细胞经PBS洗涤2次,溶于PBS中加入RNAse(10 mg/ml)5 μl,37℃作用30 min,加入(10 mg/ml)碘化丙啶(PI,Propidium iodide)10 μl。用流式细胞仪测定细胞DNA结合PI的荧光强度,在DNA的荧光直方图中,分析前向角散射光强度(FCS)和侧向散射光强度(SSC),以确定凋亡细胞的百分数,并可同时进行细胞周期的分析。
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