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从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体 |
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人源抗体的制备提供了有效的手段，我们构建了一个半合成抗体库，可从中筛选人源特异性抗体［6］。本工作为深化对抗角蛋白抗体的认识，探讨制备人源性抗角蛋白抗体的方法并为今后进一步的治疗研究奠定基础，尝试从该半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体(HAKAB)。
1 材料与方法
1.1 半合成抗体库及其他主要试剂 半合成噬菌体抗体库为本室构建［6］；大肠杆菌菌株TG1、辅助病毒VCSM13为本室保存 ；各种内切酶均为Promega产品；人表皮角蛋白(5 mg/ml)和人血清IgG型抗角蛋白自身抗体(IgG-Ak auto Ab)为第四军医大学西京医院皮肤科制备。
1.2 抗角蛋白噬菌体抗体的筛选 以人表皮角蛋白为抗原，固相化至抗原管(Immuno-tube,Nunc)后参照文献［7，8］的方法对抗体库进行4轮筛选。每轮筛选均测定次级库滴度并计算噬菌体投入产出比(回收率)作为特异性噬菌体抗体富集的指标。
1.3 噬菌体抗体的制备及检测 在筛选的最后一轮，从TYE盘中分3批共挑取97个单集落制备噬菌体抗体。以1.25 μg/ml人表皮角蛋白包被ELISA板，经1%BSA封闭后加入待测噬菌体抗体上清(1∶1稀释)，以HRP-羊抗M13为二抗，孵育、洗涤后OPD底物显色；显色阳性的克隆再以人表皮角蛋白、人IgG、胃蛋白酶、HBsAg等为抗原同时包被ELISA板，鉴定其抗原抗体反应的特异性。
1.4 抗角蛋白可溶性Fab的表达及检测 参照文献［9］介绍的方法构建和表达可溶性Fab抗体。ELISA实验包被羊抗人Fab、人表皮角蛋白及无关抗原，以HRP-羊抗人Fab为二抗，分别检测上清中人Fab的表达、与角蛋白的结合活性及其特异性。
1.5 DNA序列 赛百胜公司测定。
2 结果
2.1 抗角蛋白噬菌体抗体的筛选 经过4轮筛选，噬菌体抗体回收率得到约20倍富集。从最后一轮挑取的97个单菌落制备噬菌体抗体，经ELISA检测有20个显示与角蛋白结合活性，其中18个与人IgG、胃蛋白酶、HBsAg等无关抗原不结合，具备特异性(18.6%)。表1为从中选取的3个代表克隆与各种抗原反应的结果。
表1 噬菌体抗体与角蛋白特异性结合的ELISA结果(A490，±s)
Tab.1 ELISA results of phage antibodies against different Ags(A490，±s)
Keratin Pepsin Papain HBsAg
Clone 1 0.239±0.010 0.060±0.003 0.041±0.004 0.030±0.002
Clone 2 0.336±0.007 0.008±0.000 0.005±0.000 0.007±0.000
Clone 3 0.535±0.004 0.009±0.002 0.008±0.001 0.006±0.001
a-HBs1) 0.023±0.000 0.002±0.000 0.002±0.001 0.744±0.008
Note:1)a-HBs:anti-HbsAg phage antibody as control
2.2 抗体可变区基因的扩增及DNA指纹分析 18个特异阳性的?经PCR扩增，其中17个均扩增出κ链和重Fd链段 。扩增产物经CL-6B分子筛纯化后，以Hinf I酶切得到4种不同的酶切图形(见图1)，说明17个阳性菌落系来自4个不同的Fab基因克隆，其中1、11、12、13为1个克隆(克隆1)，2、3、5～10为1个克隆(克隆2)，4为1个克隆(克隆3)，14～17为1个克隆(克隆4)。
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