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辅佐细胞在磷酸一乙脂激活 T细胞中的作用 |
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Key words：γδT cells Monoethyl phosphate Accessory cells▲
γδT细胞是人外周血中含量很少的一类T淋巴细胞，仅占1%～10%。非肽类的小分子磷酸化合物如磷酸一乙脂(monoethyl phosphate,MEP)等能选择性激活γδT细胞，但γδT细胞对这些配体的具体识别机制还不清楚。本研究旨在观察辅佐细胞在MEP激活γδT细胞中的作用，并对其作用机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 人外周血T淋巴细胞和辅佐细胞的分离 取7名健康成年人新鲜外周静脉血，肝素抗凝，用Ficoll-Hypaque分离出外周血单个核细胞。然后用2-aminoethyl-isothiunrnium bromide hydrobromide(AET,Sigma公司)处理的绵羊红细胞分离出T细胞(T)和非T细胞，非T细胞作为辅佐细胞(accessory cells,简称A)，用丝裂霉素C(Tokyo Kyowa公司)处理辅佐细胞(50 μg/107 cells)使其丧失增殖能力。
1.2 细胞增殖实验
1.2.1 辅佐细胞对MEP 激活γδT细胞的作用 于24孔细胞培养板中每孔加入5×105T细胞，实验组每孔再加入4×105辅佐细胞，对照组加入培养液，各孔终体积为1 ml。培养液为含10%自体血清的RPMI1640，向各孔加入1 mmol/L MEP (Tokyo Kasei 公司)和40 U/ml IL-2(上海华新生物制品公司)刺激细胞增殖。同时，设只加MEP或IL-2的对照孔及MEP和IL-2共同处理的辅佐细胞孔。37℃，5%CO2连续培养9 d，每3天半量换液，第9天时计数每孔细胞数并用流式细胞仪测定其中γδT细胞的百分含量(γδT细胞数=细胞总数×γδT细胞百分含量)。
1.2.2 不同浓度辅佐细胞对MEP激活γδT细胞的作用 于24孔细胞培养板中每孔加入5×105T细胞，实验组每孔再加入不同浓度的辅佐细胞，对照组不含辅佐细胞，第9天时测定γδT细胞的数量。
1.2.3 辅佐细胞的条件培养液对MEP激活γδT细胞的作用 逐日将辅佐细胞孔的上清作为条件培养液加入T细胞孔，半量换液。辅佐细胞孔中补加含相同浓度MEP和IL-2的新鲜培养液。第9天时测定γδT细胞的数量。
1.3 细胞表型分析 采用直接荧光抗体染色，抗TCRγδ-PE单抗购自Pharmingen公司，抗CD3-FITC单抗和流式细胞分析仪(FACSC alibur)购自Becton Dickinson公司。
1.4 统计方法 采用student-t检验。
2 结果
2.1 T细胞的分离及辅佐细胞的处理 用花环沉降法分离的T细胞经流式细胞仪分析，CD3+细胞从(83.58±0.91)%提高到(95.00±2.04)%，有效地去除了单核细胞、B淋巴细胞等辅佐细胞。剩余的为少量CD3-CD2+的NK细胞，对实验结果无明显影响。辅佐细胞经丝裂霉素C处理9 d后，细胞无明显增殖。
2.2 MEP激活T细胞时需要IL-2的持续存在 由图1可见，无论是T细胞还是T+辅佐细胞对MEP的单独作用都无反应。MEP和IL-2联合作用于T细胞可使其增殖作用稍强于IL-2的单独作用，但差别无显著性(P＞0.05)。MEP和IL-2联合作用于T+辅佐细胞时促进淋巴细胞增殖的作用强于IL-2的单独作用(P＜0.05)。以上结果表明MEP活化T细胞时需要IL-2的持续存在。
图1 IL-2对MEP激活T细胞的影响
Fig.1 The effect of IL-2 on the activation of T cells by MEP
Note:*P＞0.05 vs T(I);△P＜0.05 vs T+A(I);Abbreviations:M,MEP;I,IL-2
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