|
人野生型p53 cDNA的克隆 表达和意义 |
| |
能失活。探讨p53功能失活的机制已成为肿瘤研究领域中的一个新的热点。可是，国内至今尚无此类报道。我们构建全长的人wt p53 cDNA表达质粒，表达wt p53蛋白，这为今后检测肿瘤患者血清抗p53蛋白的自身抗体，研究p53蛋白与肿瘤病毒蛋白或细胞蛋白的相互作用提供材料，对推动我国深入研究广谱的抑瘤基因—wt p53的失活特性具有重要的意义。
材料与方法
1.人p53基因的扩增：设计一对引物(5’CGC TCT AGA ATG GGG GTG GGA GGC TGT CAG3’；5’ CGC GGA TCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT3’)，以wt p53基因的cDNA为模板，用PE4800扩增仪按常规条件完成扩增，PCR产物为1.23 kb片段。
2.p53蛋白表达质粒的构建：选用含6×His片段的大肠杆菌表达载体QIA express type IV-pQE30(U.S.A)。pQE30载体和纯化后的p53基因的所需片段，T4连接酶在16℃反应2 h，得重组表达质粒。
3.大肠杆菌的转化：制备感受态的大肠杆菌M15细胞，加重组质粒和对照质粒置冰浴10 min，37℃ 3 min，冰浴2 min，这种转化细胞加入LB培养液中，37℃ 30 min，菌液铺于LB/Amp培养板上，37℃过夜，次日观察菌落。挑选部分菌落，PCR检测p53基因，鉴定转化态细胞是否插入p53基因。
4.p53蛋白的表达和纯化：转化后的大肠杆菌M15接种在50 mL LB/Amp培养液中，37℃摇孵3 h，测其0.D600≤0.6，加100 mmol/L IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃继续摇孵2.5～3 h，离心(10 000 g/15 min 4℃)菌液，PBS洗液2次，加10 mL A液(6 mol/L盐酸胍，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0)悬浮沉淀细胞，4℃过夜。用1 mL 1∶1 NAT树脂(QIA express Co.U.S.A)装柱，加5 mL ddH2O洗柱，5 mL 0.1 mmol/L NiSO4过柱，5 mL ddH2O洗柱两次，10 mL A液过柱，离心(10 000×g/min，10 min,4℃)过夜的细胞裂解液，加上清液在层析柱上。以下分部收集样品，5 mL A液洗柱，12.5 mL B液(6 mmol/L盐酸胍50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH6.0)洗柱，2.5 mL液(6 mmol/L盐酸胍，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH5.0)洗脱螯合蛋白，5 mL D液(6 mmol/L盐酸胍，50 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH2.0)洗柱。取分 部收集样品各10 μL，加ddH2O至500 μL，混匀，加50 μL 0.15%(w/v)脱氧胆酸钠，混匀后置室温5 min，离心(10 000 ×g,8 min)，弃上清，加8 μL 2% SDS/0.1 mol/L NaOH悬浮沉淀，加12 μL 2×SDS样品缓冲液混匀，沸水浴加热5 min，电泳分离。
5.SDS-PAGE电泳分离和免疫印迹分析：参照文献［4］。
结果
1.PCR扩增p53基因产物：设计的一对引物分别含有BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，模板为1.76 kb的人p53基因cDNA，扩增后的p53基因产物含有393AA(amino acid)的1.23 kb片段(Fig 1A)。
Fig 1 Recombination of pQE30-p53 expression plasmid
A: PCR products of the human wild type p53 gene, Lane 1: DNA markers (X74 Has Ⅲ); Lane 2,3: 1.23 kb PCR products of human wt 53 gene
B:Fragments of pQE30 expression plasmid digested by BamH Ⅰ and Xba Ⅰ
C:Fragemets of recombined pQE30-p53expression plasmid digested by BamH Ⅰ and Xba Ⅰ; lane1: DNA markers(Lambda DNA-Bst EII); Lan上一页 [1] [2] [3] 下一页
上一个医学论文： HL
下一个医学论文： 当归内酯拮抗环孢菌素A 氢化可的松及抗肿瘤药物的免疫抑制作用
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文