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血病的导向杀伤研究和治疗中，新近我们在成功地克隆了新型导向毒素蛋白PE40基因的基础上［5］，又从HL-60细胞中克隆了含编码人IL6的cDNA并进行了序列分析，以便为探索性构建重组毒素IL6-PE40融合蛋白奠定基础。
材料与方法
1.材料：RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、PCR DNA回收试剂盒、质粒纯化试剂盒、各种DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶等工具酶均购自Promega公司。RPMI1640细胞培养基购自GIBCO/BRL公司。其他常规化学试剂为进口或国产分析纯产品。E.coli HB101由军事医学科学院基础医学研究所提供，pUC18质粒购自MBI公司，引物
由军事医学科学院放射医学研究所合成，PCR扩增仪为PE-480。
2.细胞株：人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60细胞由军事医学科学院放射医学研究所鱼咏涛惠赠。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液传代培养，置37℃、5% CO2条件下培养3 d。
3.HL-60细胞总RNA提取：收集培养细胞(108左右)，4℃300×g(1 000 r/min)离心5 min，用25 mL的预冷灭菌的1×PBS洗涤沉淀，离心后弃上清。加入8 mL预冷的异硫氰酸胍变性溶液裂解细胞，再加入4 mL，变性液裂解残留的细胞，用匀浆器匀浆上述12 mL细胞裂解物，然后转移到一灭菌离心管中，加1.2 mL 2 mol/LNaAc(pH4.0)、12 mL苯酚：氯仿：异戊醇混合液，置冰浴15 min，4℃ 10 000×g(14 000 r/min)离心20 min，吸取上清，加入等体积的异丙醇，置-20℃至少30 min，4℃ 10 000×g(14 000 r/min)离心15 min沉淀RNA，把RNA重新溶解在5 mL的变性溶液中，加等体积异丙醇，离心取RNA沉淀，用75%冷乙醇洗涤沉淀，凉干后将沉淀溶于适当体积的无RNase的去离子水中。-20℃保存。
4.反转录PCR：以提取的RNA为模板，以PCR的上、下游引物为引物，进行反转录，反应参数参照试剂盒说明。
5.IL6重组质粒的构建及序列分析：DNA酶切、连接、转化、质粒鉴定均按《分子克隆》有关章节进行，IL6 cDNA的序列分析采用DNA自动测序仪进行。
结果
一、RT-PCR扩增IL6cDNA的引物设计：
为了便于克隆IL6cDNA以及进一步与PE40基因构建成重组IL6-PE40外毒素融合基因，根据IL6的全长基因序列，通过计算机模拟分析，设计了下述两组扩增IL6cDNA的引物：a组：上游引物为5 CGCGAATTCATGATTGACAAACAAATTC3’，下游引物为5’CCGGATCCTTACATTTGCCGAAGA 3′，所扩增的480 bp片段为N-末端缺失24个氨基酸的人IL6cDNA［6］。该对引物具有以下特点：①上、下游引物分别引入EcoR I和BamHI酶切位点，以使重组操作简单易行；②在EcoR I和BamHI酶切位点前分别设制2个保护碱基以保证酶切效率；③上、下游引物的5’端各含有起始密码子ATG和终止密码子TAA， 从而可确保经PCR扩增的产物为IL6 cDNA片段。b组：上游引物与a组相同，下游引物为5’CGACCCACCACCGC-CCGAGCCACCGCCACCGCTTCCACCGCCTCCAGATCCG-
CCGCCACCCATTTGCCGAAGAGCCCTC3’，该下游引物的5’端含有一60 bp的接头且与扩增PE40基因的上游引物5’端互补，以利于构建重组IL6-PE40外毒素融合基因。
二、pUC-IL6重组质粒的构建及序列分析：
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