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沙土鼠及大鼠局部脑缺血时血小板活化因子的变化 |
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法
一、实验动物：
健康沙土鼠，雌雄不拘，体重(67±4) g()；Wistar大鼠，雄性，体重(355±24) g，由本院动物科供给。
二、脑缺血动物模型的复制：
1.沙土鼠单侧脑缺血及再灌模型：首先参照Masayasu方法［4］对实验动物进行筛选：由于只有30%沙土鼠两侧大脑前动脉间缺乏交通支，因而只有这部分动物在结扎一侧颈总动脉后，才有可能复制单侧脑缺血。预选方法为：沙土鼠以100 mg/kg氨胺酮(ip)麻醉，颈前正中切口，分离左侧颈总动脉，将小橡皮条贴附于该动脉上，然后用丝线一并结扎，60 s后剪断丝线，抽出小条让动脉再通，观察30 min沙土鼠神经症状，参照Masayasu标准计分，最高分为7分，凡计分在2～7之间的选为实验动物。
将挑选的沙土鼠用乙醚吸入麻醉，按上述方法分离并结扎右侧颈总动脉，缺血3 h，剪断结扎直视血管再通，再灌2 h后用乙醚再次麻醉，断头取脑。立即将脑组织置于含0.18%甲酸的冰生理盐水中1 min，使乙酰水解酶失活，随即取出大脑迅速分离左右大脑半球并称重量。
2.大鼠局部脑缺血模型：大鼠以12%水含氯醛按400 mg/kg(i p)麻醉。按Peter法在颧弓和鳞状骨融合点侧1 mm暴露左侧大脑中动脉。用高频电刀电灼凝闭该侧大脑中动脉，术后放回原条件下继续饲养48 h后，水合氯醛再次麻醉动物，断头取脑，按前面所述方法处理脑组织。
三、PAF含量测定方法：
参照Tokumura法［6］淬取脑中脂质。用薄层层析法分离PAF，从层析板取与PAF标准品同比移植(RF)部分，用150 μL氯仿再提取，氮气吹干后溶于50 μL台氏缓冲液中待测。
用血小板聚集法测脑组织中PAF含量：制备富含血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，将血小板浓度调至35×109/L～40×109/L，测定血小板聚集幅度，根据标准品PAF剂量效应曲线计算出PAF含量。
四、对提取PAF的鉴定(参照Benvensite法［7］)：
1.磷脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)处理：将从薄层层析板上刮下的提取物与PLA2在37℃温育15 min观察对PRP聚集的影响。
2.消炎痛及磷酸肌酸/磷酸肌酸激酶处理：在PRP中加入消炎痛(2 mg/mL)、磷酸肌酸(62.5 μg/10 μL)，磷酸肌酸激酶(30.5 μg/10 μL)，观察提取物对血小板聚集的影响。
结果
一、PAF的剂量-效应曲线：
10 pg的PAF引起的血小板聚集率为10.6%，60 pg为75.0%，在此剂量范围内呈线性量效关系，r=0.999。
二、提取PAF的鉴定：
与PLA2温育过的从薄层层析板上刮下的提取物不能引起血小板聚集。用消炎痛及CP/CPK处理过的血小板，加入从薄层层析板刮下的提取物后，可见典型的聚集反应。
三、PAF测定的结果：
1.沙土鼠单侧脑缺血后左右大脑半球PAF含量的变化，如表1所见。
表1 沙土鼠单侧脑缺血后3 h再灌2 h后PAF含量的变化
Tab 1 The changes of brain PAF content in gerbils subjected to 3 h
unilateral cerebral ischemia followed by 2 h reperfusion ()
n PAF(pg/g)
Nonischemic brain 12 1.30±0.42
Ischemic brain 12 4.40±0.90*
* P＜0.05，vs nonischemic brain
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