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大鼠肝再生过程中线粒体氧化磷酸化的调控 |
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in cellular energy demand for rat liver regeneration, as was obtained by some regulatory mechanism which might reduce permeability of the inner mitochondrial membrane after partial hepatectomy.
MeSH Liver regeneration; Mitochondria; Oxidative phosphorylation; Rats
肝脏的外科手术或有害因素对肝脏损伤后，残存的肝细胞很快会进入一个复杂的再生过程，这个再生过程与细胞的能量供应密切相关，用于合成细胞各种组分的能量需求增加［1］。正常情况下细胞能量供应主要由线粒化氧体磷酸化提供。有研究表明肝再生时线粒体形态发生了较大的变化，表现为肿胀、增大及聚集等［2］，还有研究发现肝再生时细胞能量需求增加，线粒体功能增强［1，3］，而另外研究发现肝再生早期线粒体ATP合成酶活性减低［4］，呼吸功能下降［5］。因此，这方面的研究结果存在较大差别。为此，本文研究分析肝再生不同时期的线粒体氧化磷酸化诸多参数，以探明肝再生过程中线粒体氧化磷酸化的时相变化规律，为肝再生机制的认识提供一些实验依据。
材料与方法
(一)实验动物模型与分组：雄性Wistar大鼠(200～250 g)，本校实验动物中心提供，参照文献［6］复制肝脏部分切除模型。用乙醚麻醉动物，切除大鼠肝的中叶和左叶，约占肝脏的65%～70%，分别在手术后0.5、1、2、4和7 d时断头取肝制备线粒体，这样分成5个肝再生实验组；同时设5个相应的对照组，对照组的大鼠同样用乙醚麻醉和手术处理但不切肝，并在同样的时点断头取肝分离线粒体。每组为5只大鼠。
(二)主要试剂与仪器：鱼藤酮、腺苷二磷酸(ADP)为Sigma公司产品，蔗糖、甘露醇、琥珀酸、谷氨酸和苹果酸等为国产AR级试剂。主要仪器CR21高速冷冻离心机(日立公司)，SP-2溶氧测定仪(上海植生所)。
(三)肝线粒体的分离：参照文献［7］，动物断头取肝，称重，按10 mL/g tissue加分离介质(250 mmol/L蔗糖、220 mmol/L甘露醇、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA, 0.25%牛血清白蛋白，pH7.4)，用Teflon芯的玻璃匀浆器匀浆，差速离心分离线粒体，制成合适的线粒体悬液。双缩脲法测定线粒体悬液的蛋白量，整个过程严格在冰浴中进行。
(四)肝线粒体氧化磷酸化功能参数测定与计算：
1.测定条件：在25℃密闭的连续搅拌的反应体系用氧电极测定线粒体的耗氧速率来反映线粒体的功能。加入测定介质(75 mmol/L蔗糖、220 mmol/L甘露醇、20 mmpl/L KCl、5 mmol/L MgCl2、 5 mmol/L K-Pi,20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L EDTA、pH7.4)和线粒体(1 mg蛋白/mL)后描记本底耗氧(Ⅰ态呼吸)，加入底物琥珀酸或谷氨酸+苹果酸后耗氧加快(Ⅱ态呼吸)，加入ADP刺激呼吸明显加快(Ⅲ态呼吸)，待ADP消耗完后耗氧又减慢(Ⅳ态呼吸)，用记录仪连续描记这呼吸曲线后进行计算。
2.计算方法：①耗氧速率(QO)=氧饱和度×单位时间耗氧格数×反应体积×2/定标格数，单位nmols O/min.mg-1pr.;②呼吸控制率(RCR)=Ⅲ态耗氧速率/Ⅳ态耗氧速率；③磷氧比值(P/O)=ADP(nmoles)/Ⅲ态耗氧总量。
(五)统计处理：实验数据用()表示，显著性检验用t检验。
结果
图1示大鼠肝部分切除后不同时间里肝线粒体以琥珀酸为底物的RCR变化，上面曲线为肝部分切除组，下面曲线为对照组。从图上可以看出肝部分切除后0.5 d时RCR为最高， 明显高于对照组(P＜0.01)，以后逐步下降，2 d时为最低但仍高于对照组，而后又升高，至4 d时又显著高于对照组(P＜0.05)，第7 d时接近对照组；图2是以苹果酸+谷氨酸为底物的肝线粒体RCR的变化曲线，基本与图1的情况相似，但变化更明显，同样在肝切后0.5和第4 d为高峰与对照组相差极显著(P＜0.01)，第1和第2 d也显著高于对照组(P＜0.05)。对照组的肝线粒体RCR在整个实验过程中波动很小。
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