|
丙肝病毒融合抗原基因NS3 |
| |
lysis showed that the chimeric gene NS3-C had been integrated into chloroplast genome of Chlamydomonas reinhardtii.
Key words: Hepatitis C virus; Gene fusion; Chloroplast transformation; aadA gene; Chlamydomonas reinhardtii
利用转基因植物作为生物反应器来表达各种异源蛋白, 已成为分子生物学领域中新的研究热点。目前在转基因植物中已成功表达了多种抗体〔1, 2〕、激素〔3〕、酶〔4〕、细胞分裂素〔5, 6〕、血浆蛋白〔7〕和疫苗〔8, 9〕等。
莱茵衣藻是目前唯一的染色体、叶绿体和线粒体三套基因组均能遗传转化的植物。1990年, Kindle等报道了衣藻的高频核转化〔10〕，但外源基因的非同源随机整合，很容易导致核基因组其它基因的功能受到影响。叶绿体转化由于具有位点专一的同源重组、高效表达和母系遗传等特点〔11, 12〕，因而使叶绿体作为生物反应器来生产各种异源蛋白成为可能。莱茵衣藻细胞中含有一巨型叶绿体，占细胞总体积的40%～60%，加之其遗传背景清楚，易于培养，操作方便等特点，因此成为叶绿体基因工程研究的理想材料。目前国际上已经在衣藻叶绿体中表达出AAD蛋白和GUS蛋白〔13〕，而国内则尚无此方面的报道。本研究以莱茵衣藻叶绿体为受体，尝试通过基因枪法将丙肝病毒融合抗原基因NS3-C导入到叶绿体中，一方面可填补我国在该领域的研究空白，同时也可为利用植物生产丙肝疫苗打下基础。
1 材 料 和 方 法
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌（E. coli）菌株DH5α、质粒pBluescript SK(M13)、pUC119为本室保存；质粒patpX、pUC-atpX-AAD、pCQ5由英国John Innes Centre固氮实验室程奇博士惠赠，其中patpX上克隆有衣藻叶绿体atpA基因5 端启动子、rbcL基因3 端终止子和一组多克隆位点，pUC-atpX-AAD上克隆有选择标记基因表达盒5 atpA-aadA-3 rbcL，质粒pCQ5克隆有5.2 kb的衣藻叶绿体同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2-rps19, 其中缺失chlL结构基因约1.0 kb，并在chlL 5 和chlL 3 之间引入多克隆位点EcoRⅤ、BamHⅠ、SacⅠ、AvrⅡ、BsmⅠ；质粒pHF由中国科学院上海生物化学研究所吴祥甫研究员惠赠，其中克隆有HCV cDNA基因组。
1.2 野生型衣藻(Chlamydomonas reinhardti 137C)
由英国John Innes Centre程奇博士提供，培养方法参见文献〔14〕。
1.3 工具酶及分子生物学试剂
各种限制性内切酶、Klenow酶、T4 DNA ligase、T4 DNA polymerase、Taq DNA polymerase、引物标记试剂盒等均购自美国Promega公司，DNA回收试剂盒购自Clontech公司，其它各种试剂均为进口或国产分析纯试剂，同位素(α32-P-dATP)购自北京亚辉生物工程公司。
1.4 引物
根据已发表的丙肝病毒基因组序列设计如下引物:
引物1: 5 -GGGAAGCTTATGGCTCTAGAGCCGGCTGCATAT(33nt)
引物2: 5 -TTACAGATCTAAGCTGAAATCGACTGT(27nt)
引物3: 5 -CCGGGATCCGucuccggguucuATGAGCACGAATCCTAAAC(38nt)
引物4: 5 -CTAGTCGACTATTAGGCTGACGCGGGCACGGT(32nt)
上述引物由美国Cybersyn公司合成，小写部分为连接肽SPGS的密码子序列。
1.5 常规分子操作
质粒DNA的提取、酶切、连接以及连接产物的转化等参见文献〔15〕。
1.6 衣藻叶绿体转化
1.6.1 受体细胞的准备 取1.5 ml在TAP〔14〕液体培养基中生长至对数后期(约5～6×106 cells/ml)的野生型衣藻，于1.5 ml eppendorf离心管中浓缩(6 000 r/min,上一页 [1] [2] [3] 下一页
上一个医学论文： 如何查找Internet网上的基因突变信息资源
下一个医学论文： 多种微生物搭载返回式卫星的试验研究
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文