|
温石棉改性前后对人胚肺细胞癌基因改变的比较 |
| |
片机(刻度调至5 μm处)切割后，置60 ℃ 烤箱中烘干备用。临用前将石棉加入双蒸水中，超声10分钟，并用混悬器振荡2分钟，配成浓度均匀的混悬液。
3. 石棉纤维的预处理：将一定量的温石棉悬液与相同浓度的混合稀土、柠檬酸铝或亚硒酸钠溶液相混后，分别在室温下作用1小时，2 000 r/min离心10分钟，弃去上清液后，再用PBS将下部沉淀配成浓度均匀的混悬液。
二、细胞染毒
将细胞接种于25 ml培养瓶中（1×105/ml），培养24小时后，用石棉或浸泡过的石棉悬液染毒24小时，弃培养液，用D-hank液洗3遍，传代后培养24时，重复染毒24小时，去毒后传代。培养24小时后，再次染毒24小时，弃培养液，用D-hank洗3遍，加入新鲜的MEM（含10％的小牛血清）继续培养。此后，3天传代1次，传至第10代时，将细胞转移至大瓶中培养，测定P21ras蛋白的含量。同时提取细胞总RNA，用Dot Blotting分析c-Ha-ras癌基因的转录活性。
三、P21ras蛋白含量测定(流式细胞术)
将上述转至大瓶中培养的细胞消化后，用含5％小牛血清的PBS洗2遍，按照文献［2］所述方法测定P21ras蛋白含量。Ⅰ抗为美国Santa Cruz公司生产的P21ras，FITC标记的Ⅱ抗为美国Jackson公司生产的羊抗小鼠IgG。
四、c-Ha-ras癌基因转录活性的测定［3，4］
1. 细胞总RNA的提取及比色鉴定：细胞用冰冷的PBS洗2～3遍，加入0.5 ml冰冷的变性液将其消化裂解，加入2 mol/L醋酸钠0.05 ml(pH值4.0)、酚、氯仿-异戊醇(49∶1)0.5 ml，振荡混匀，冰浴20分钟，4 ℃10 000 r/min 离心20分钟，转移上相至新管中，同上重复抽提1次，取上层水相与等体积异丙醇混合，-20 ℃ 1小时，4℃12 000 r/min 15分钟，弃液相，沉淀溶于600 μl变性液中，加等体积异丙醇再次沉淀，4 ℃ 12 000 r/min 离心15分钟，沉淀用75％乙醇洗涤，真空干燥，溶于DEPC处理的去离子水中，紫外分光光度计比色定量后分装，-70 ℃保存备用。
2.探针标记：随机引物法标记双链DNA探针(GIBCO公司，RADPRIME LABELING SYSTEM)。取25 ng双链DNA纯化片段，变性后置冰浴中，加入相应的缓冲液和dNTPS, 3～5 μg 32P核素标记的核苷酸，加入1 μl Klenom酶，轻柔混匀，37 ℃温浴20～40分钟，标记之后变性、冰浴，测定比活性后使用。
3.细胞总RNA的电泳鉴定：取20 μg已定量的RNA，体积定为5 μl，加入10×MOPS 1 μl、甲醛3.5 μl、去离子甲酰胺10 μl，68℃温浴15分钟，使样品变性，加入2 μl甲醛凝胶加样缓冲液，水浴，同时用1×MOPS配制1%的凝胶，微波炉溶胶，冷却至60℃，加入甲醛使终浓度为2.2 mol/L，铺胶，上样，在1×MOPS缓冲液中20～40 V电泳6～12小时，当溴酚兰走至凝胶全长3/4时停止电泳，用0.5 μg/ml EB染色，长波紫外灯下拍照记录。
4.Dot blotting分析: 将5 μg和7 μg RNA直接点到Bio-Rad尼龙膜上，80℃真空烘烤2小时，固定RNA(同时将RNA点到尼龙膜上，用β-actin杂交作为对照)。将尼龙膜装入塑料杂交袋，加入预杂交液, 65℃预杂交5分钟，倒尽预杂交液，按150 μl/cm2膜加入杂交液，65℃杂交24小时，弃尽杂交液后，用洗膜液洗膜，以微型同位素检测器检查膜上放射线强度，在10 cpm时终止洗膜。将湿润的尼龙膜封入保鲜膜中，同富士X线胶片一起夹于配有增感屏的X线暗盒内，-70℃条件下曝光，时间为1～2周，胶片经显影、定影后，观察结果。
上一页 [1] [2]
上一个医学论文： 矽肺患者血中一氧化氮和脂质过氧化水平的变化
下一个医学论文： 人造矿物纤维对肺泡巨噬细胞的毒作用研究
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文