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中国部分地区新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病学 |
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tioned strains and Japanese ones. Conclusion There existed TTV infection in both north and south China. TTV infection correlated closely with abnormal ALT, which might be an important pathogen for non-A, non-B, hepatitis G. There were somebodies infected with TTV in the normal healthy population, similar to that of “chronic carrier status” in hepatitis B.
【Key words】 Hepatitis viruses Polymerase chain reaction TT virus
1997年底，日本学者报道了一种与肝功能异常有关的DNA病毒［1］，并将之命名为T.T 病毒(TTV),初步的研究表明，这种病毒可能是一种新的输血后非甲～非戊型肝炎的致病病原。我们的研究表明，在我国人群中也存在TTV感染［2］。开展TTV感染的流行病学调查，了解我国人群中的感染状况，分析TTV与临床肝炎的关系，探讨TTV在肝炎发病中的作用与地位等，对肝炎的防治具有重要意义。为此，我们对我国几个地区的不同人群进行了分子流行病学研究，结果如下。
对象与方法
1. 调查人群与标本来源：非甲非庚型肝炎病人血清分别采自北京地坛医院、佑安医院、南京八一医院和深圳宝安西乡医院，根据病历登记调查有关的个人资料。所用标本均是1997年2月～1998年3月间收集的入院就诊病人血清。献血员血清采自1998年2～4月深圳宝安血站自愿献血点连续1周的所有献血员，采血的同时进行流行病学调查，包括献血、输血、使用血制品史和肝炎病人接触史。
2. 检测指标及检测方法：对所有的标本用套式PCR检测血清中的TTV DNA。同时排除甲～庚型肝炎病毒的感染以及EBV、CMV感染引起的肝炎，并排除自身免疫性疾病、药物性肝炎、酒精性肝炎和阻塞性黄疸等。
（1）排除甲～庚型肝炎病毒感染的方法：甲型肝炎用ELISA法检测抗-HAV IgM；乙型肝炎分别用ELISA法检测HBsAg、抗-HBc IgM和抗-HBeAg，用PCR法检测HBV DNA； 丙型肝炎用ELISA法检测抗-HCV IgG，用RT-PCR法检测HCV RNA；丁型肝炎检测抗-HDV IgM；戊型肝炎用ELISA法检测抗-HEV IgG和IgM；庚型肝炎用RT-PCR法检测HGV RNA。CMV 和 EBV感染分别用ELISA法检测抗-CMV IgM和抗-EBV IgM,ELISA试剂均购自美国Abbott公司，PCR试剂为本室产品。
（2）套式PCR检测血清TTV DNA的方法：采用STG试剂盒（购自美国Biotronics Tech.Corp公司）提取血清中的病毒DNA。取50 μl血清，加60 μl STG缓冲液，混匀，100℃变性5分钟，13 000 g离心10分钟，挑除变性蛋白，加90 μl异丙醇沉淀，室温离心，沉淀物干燥后用无菌水10 μl溶解备用。套式PCR检测TTV-DNA： P1/P2为外引物，序列分别为：P1: 5 -CCAGGAGCATATACAGAC-3 ，P2: 5 -TGTACT-TCTTGCTGGTGAAAT -3 ；P3/P4为内引物，P3: 5 -ACAGACAGAGGAGAAGGCAAC-3 ，P4: 5 -AACAGG-CACATTACTACTACC-3 。第1轮PCR反应条件：取模板4 μl、10×PCR 缓冲液3 μl、dNTPs 0.8 μmol/L、P1/P2 0.1 μmol/L，30 μl反应体积，94℃预变性180秒，94℃ 40秒，55℃ 40秒，72℃ 45秒，扩增35个循环。取第1次PCR产物2 μl作模板、10×PCR 缓冲液3 μl、P3/P4 0.1 μmol/L、dNTPs 0.8 μmol/L，30 μl反应体积进行第2次扩增，循环条件为：94℃预变性180秒，94℃ 40秒，55℃ 40秒，72℃ 40秒，扩增30个循环。取2次PCR产物10 μl用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。每次均设阳性及阴性对照。
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