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维生素K对幼鼠骨代谢的影响 |
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tamin K Bone dinsity
维生素K(VK)是一种脂溶性维生素， 多年来人们认识维生素K的生理作用在于维持机体正常的凝血机能。维生素K参与人体骨代谢的假说首次在1975年由国外学者Pettifor和Benson提出[1]， 近年来，随着维生素K依赖性骨蛋白的发现与深入研究，许多资料提示，营养学家建议的维生素K供给量不能满足骨源性蛋白骨钙素的充分羧化［2］。短期动物实验发现，维生素K缺乏会引起大鼠尿钙排泄增加［3］，骨钙素羧化水平下降［4］，表明机体骨分解代谢增强，骨形成代谢减慢。 但关于摄入不同水平的维生素K对骨代谢的影响尚未见报道。
本课题通过给断乳大鼠饲以不同水平的维生素K1，主要从骨代谢生化指标及骨密度测定结果观察维生素K对大鼠骨代谢的影响。
材料与方法
一、动物来源及分组
实验选用雄性Wistar断乳大鼠40只，体重50 g±6 g，由中国医学科学院动物中心提供，按体重随机分为4组， 分组情况如下： ①VK缺乏组（饲料中含1%磺胺嘧啶，阻断大鼠体内肠道菌群VK的合成）；②低剂量组（饲料含VK 50 μg／kg）；③中剂量组（饲料含VK 300 μg／kg）；④高剂量组（饲料含VK 2 550 μg/kg）。
二、动物喂养及饲料
大鼠单笼饲养，自由进食，饮去离子水，动物房温度保持在20～25℃，湿度50%左右，记录进食量，每周称体重1次，实验期3个月。饲料配方参照Joht和Doisy［5］的实验研究，经测定基础饲料VK含量为50 μg/kg，钙含量5.7 g/kg，缺乏组在基础饲料基础上添加1％磺胺嘧啶，低剂量组饲以基础饲料，中高剂量组分别在基础饲料中添加250 μg和2 500 μg VK，使分别达到每公斤饲料含VK 300和2 550 mg(VK为Sigma公司产品)。基础饲料配方：黄豆粉41%、蔗糖20%、淀粉29.7%、花生油4.0%、混合无机盐1.75%［6］、混合维生素1.35%［7］、DL-蛋氨酸0.1%、CaH2PO4·H2O 2.17%。
三、样品收集及处理
实验第6周进行钙代谢实验，严格记录进食量，收集大鼠72小时尿与粪便，尿加6 mol/L盐酸（1∶50），置低温冰箱冷冻保存，粪便直接冷冻。实验结束前大鼠禁食1夜，次日晨在乙醚麻醉下由腹主动脉取血，摘取肝脏及双侧肾脏，用冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，立即称重。剥离出双侧股骨。
四、测定指标及方法
1．血清、尿液、粪便和饲料中钙含量的测定：尿液直接用0.5%氧化镧溶液稀释后用原子吸收光谱法测定，粪便、血清、饲料消化稀释后测定。
2．钙代谢实验：
吸收率=（摄入钙-粪钙）/摄入钙
存留率＝（摄入钙-粪钙-尿钙）/摄入钙
3．尿肌酐(Cr)：苦味酸法。
4．尿羟脯氨酸(HOP)：氯胺T法。
5．血清碱性磷酸酶（ALP）：磷酸苯二钠法。
6．血清骨钙素：放免分析法(RIA)，试剂盒由北方免疫试剂研究所提供，批内变异CV＜5%，批间变异CV＜10%。
总骨钙素（OCtotal）：直接测定。
游离骨钙素（OCfree）：根据骨钙素与羟基磷灰石结合的性质，血清中加入羟基磷灰石（100 mg/ml），进行羟磷灰石吸附实验，离心（2 550 r/min）后取上清，RIA法测上清骨钙素含量，即为游离骨钙素含量。
结合型骨钙素（OCbound）：血清OCtota与OCfree的差值。
骨钙素结合率（％)：OCbound/OCtotal
7．凝血时间（PTH）：常规法（Quick一期法），IL 810全自动凝血分析仪，Coulter公司，USA。
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