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膈下迷走神经切断术抑制腹腔给予LPS诱导的延髓内脏带内Fos表达 |
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n)能神经元，可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)或下丘脑-脊髓-交感神经轴参与免疫调节［1］。近年研究发现大鼠、猴和人的延髓中尾段均存在一条从背内侧经中间网状结构至腹外侧的弧形带状区，因与内脏活动(心血管、呼吸和胃肠活动等)有密切关系，故称之为延髓内脏带(medullary visceral zone,MVZ),MVZ这一新的概念已被国际学术界认可［2］。MVZ被划分为背内侧部［DM，包括孤束核(NTS)、迷走神经背运动核(dmnX)及最后区(AP)］、腹外侧部［VLM，包括疑核(nA)、外侧网状核(LRt)及腹外侧网状核(VLRt)］和中间网状带(IRt，指位于两者之间的弧形网状带)三部分，延髓生命中枢位于MVZ内［3］。MVZ对免疫反应的刺激也很活跃，将免疫激活剂脂多糖(LPS)注入腹腔［4］或将白细胞介素-1β(IL-1β)注入侧脑室［5］，均在MVZ内见到许多Fos阳性神经元，其中多为儿茶酚胺能，有的投射至脊髓中间带外侧核。迷走神经可能是“免疫-脑通讯”(immune-to-brain communication)的途径之一，机体内可能还存在“MVZ-迷走神经-免疫器官”的“免疫-脑通讯”调节通路。为此，我们切断大鼠双侧膈下迷走神经，观察再经腹腔给予LPS后MVZ内的Fos表达情况，以证明“迷走神经→MVZ”通路参与神经免疫调节的可能性。
材料和方法
成年雄性上海SD大鼠24只，体重180～230g，置于安静、温暖(20℃)、避强光的环境中饲养48h，随机分为实验组(n=20)和对照组(n=4)。
1. 实验组
1.1 动物手术及切片制备(n=20)：实验组动物进一步随机分为迷走神经切断(SDV)组(n=10)和假手术(Sham)组(n=10)。SDV组动物经1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉下行剖腹术，在手术显微镜下，于胃小弯处暴露迷走神经左右两干支，距离迷走神经各分支(胃支、肝支和腹腔支)约5mm，丝线结扎左右两干支并切断。Sham组动物，同样暴露迷走神经左右两干支，但不结扎也不切断迷走神经。术后给予固体食物。动物存活4周后，乙醚吸入麻醉，腹腔分别注射300μl灭菌生理盐水溶解的LPS(Sigma,0127:B8,100μg/kg)和300μl灭菌生理盐水(NS)，动物再存活3h。戊巴比妥钠深麻下，开胸经左心室至升主动脉插管，先以100ml生理盐水冲洗血液，随后用冷的(4℃)含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)灌流固定。灌毕取脑置于含30%蔗糖的0.1mol/L PB内(4℃)，直至组织块沉底。切取延髓，冰冻连续冠状切片，片厚30μm,隔6张取1张。
1.2 染色反应：切片则按ABC法进行抗Fos免疫组织化学反应，切片先入含0.3%Triton X-100的PBS浸泡30min(室温)，后依次入：(1)兔抗Fos抗体稀释液(1∶1 000，Santa Cruz)，孵育48h(4℃)；(2)生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)，放置3h(室温)；(3)生物素-卵白素-HRP复合物(ABC，1∶500,Sigma)，放置3h(室温)。最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法呈色。以上每一步骤之后均用PBS液充分漂洗3次，每次10min。切片漂洗后裱片、晾干、脱水、透明、封固，光镜下观察并摄片。
1.3 数据处理：切片经图像分析仪(Quantimet570C,Leica)处理。Fos阳性细胞计数分别选择MVZ内DMM、IRt和VLM。每只大鼠随机选取一套延髓切片，在10(目镜)×20(物镜)倍率下，计算该套切片中MVZ内上述各部Fos阳性细胞的总和，而后在每组动物间取均数。最后各实验组之间Fos阳性细胞数比较采用t检验进行统计分析。
1.4 免疫组织化学染色替代实验：取实验组大鼠延髓切片，用0.01mol/L PBS代替兔抗Fos第一抗体，再按ABC法进行免疫组织化学染色。
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