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反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质细胞的作用 |
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ound or ellipse.The process of this cell became fine or retracted,the ratio of nuclei/cytoplasm was larger.The staining of GFAP substance was reduced and transcription level of GFAP mRNA was down-regulated. Conclusions We obtained a normal construction of the antisense GFAP retrovirus expressing vector,and confirmed that this vector could effectively inhibit the growth and GFAP expression of normal and reactive astrocyte in vitro.
【Key words】 Astrocyte;Retrovirus;Glial fibrillary acidic protein;Brain injury
星形胶质细胞(astrocyte,Ast)在中枢神经系统(CNS)中起着重要的作用，它不仅参与了CNS各种生理功能的调节，而且在CNS的多种病理变化中，尤其是在CNS的损伤修复中起着重要的作用。研究发现，胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)对维持Ast的形态结构及功能具有重要作用，抑制GFAP基因表达，可能影响Ast的生长、增殖，以及Ast对损伤的反应［1］。反义核酸技术是目前人工干预基因表达的一项重要技术，它利用人工合成或重组的，与靶基因互补的一段反义DNA或RNA片段，特异性的与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。本研究采用基因重组技术，成功构建了反义GFAP逆转录病毒表达载体，通过体外实验研究了其对培养正常及反应性Ast形态结构、GFAP基因表达的影响，并探讨了作用机制与意义。
材料和方法
1. 主要材料
内切酶SaⅡ、HindⅢ、EcoRI、XhoI及M-MLV逆转录酶为Promega公司产品，Lipofectin、G418、Dulbecco modified Eagle medium(DMEM)为GIBCO公司产品，细胞系PA317、NIH3T3、ψ2为军事医学科学院贺福初研究员惠赠，胎牛血清为天津血制品研究所产品，TriPure试剂盒为宝灵曼公司产品，免疫组织化学与原位杂交试剂为中山公司产品。
2. 重组反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建与鉴定
质粒pBR322/GFAP(含GFAP基因第1外显子起始密码区1.1kb DNA片段，由美国纽约大学医学中心Nicholas J.Cowan教授惠赠，用Sal I和Hind Ⅲ双酶切后，回收目的片段，亚克隆至pBluscript sk-载体上，重组子命名为BskG。在插入位点的外侧，用EcoRI和XhoI双酶切BskG质粒，回收目的片段，反向插入逆转录病毒载体PLXSN上，重组子命名为PLBskG，酶切鉴定及序列分析。
3. 病毒包装与滴度测定
PLBskG及空载体PLXSN质粒用脂质体Lipofectin包裹后转染PA317细胞，G418筛选2周，随机挑选各4个克隆细胞扩增培养，收获病毒上清，感染NIH3T3细胞，G418筛选，根据克隆形成数，计算病毒滴度。挑选滴度高的克隆细胞继续扩增培养。收获的病毒上清，交叉感染ψ2及PA317细胞，重复两次，再次测定病毒滴度。
4. Southern杂交鉴定PLBskG在包装细胞中的整合
提取病毒感染的PA317细胞基因组DNA，酶切后，凝胶电泳分离，转NC膜，32P-GFAPcDNA探针进行Southern杂交。
5. RT-PCR检测目的基因在NIH3T3细胞中的表达
用TriPure试剂盒提取PLBskG感染的NIH3T3细胞总RNA，经M-MLV逆转录酶反转录成cDNA后，PCR扩增，凝胶电泳分析。GFAP引物上游序列为：5′-CTGAATTCTGCTGGCTTCA-AGG-3′，下游序列：5′-CTAAGCTTGCTCTGCG-TTGCGG-3′，扩增片段增长624bp。β-actin引物上游序列为，5′-GCG-GGAAATCGTGCTGACATT-3&prime上一页 [1] [2] [3] 下一页
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