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反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质细胞的作用 |
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黄其林 蔡文琴 张可成
【摘要】 目的 构建反义GFAP逆转录病毒表达载体，评价其对培养正常及损伤星形胶质细胞(Ast)形态及GFAP基因表达的影响。 方法 用定向克隆技术，将1.1kb的GFAP基因片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN上，获得重组体PLBskG，经病毒包装、抗性克隆筛选、滴度测定等，挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养，收获病毒上清液感染体外培养的Ast，通过免疫组织化学、原位杂交、RT-PCR、Southern blot和流式细胞仪分析等方法，研究PLBskG对正常及损伤Ast的生长、细胞增殖周期、细胞形态结构、GFAP基因表达的影响。 结果 插入PLBskG中的GFAPcDNA片段序列、方向完全正确，Southern杂交及RT-PCR分析表明，PLBskG成功整合入PA317细胞中，并实现了在NIH3T3细胞中的表达。PLBskG使正常及反应性Ast生长抑制，G1期阻滞，Ast胞体变圆、胞浆减少、突起变细、回缩，核浆比例增大。GFAP免疫组织化学染色减弱；GFAP mRNA表达水平降低。 结论 获得了构建正确的反义GFAP逆转录病毒表达载体，并证实其对正常及反应性Ast形态结构、GFAP表达水平等均有明显的影响，为深入研究Ast反应及GFAP基因的功能创造了条件。
【关键词】 星形胶质细胞；逆转录病毒；胶原纤维酸性蛋白；脑损伤
【中图分类号】Q189 【文献标识码】A
【文章编号】0529-1356(2000)02-102
THE CONSTRUCTION OF ANTISENSE GFAP RETROVIRUS
EXPRESSING VECTOR AND THE EFFECT ON ASTROCYTE
HUANG Qi-lin,ZHANG Ke-cheng
（Department of Neurosurgery,Xingqiao Hospital,）
CAI Wen-qin
（the Third Military Medical University,Chongqing 400037,China）
【Abstract】 Objective To recombinant antisense GFAP retrovirus expressing vector and to investigate its effect on morphology and GFAP expression of normal,reactive astrocyte. Methods A 1.1kb from the coding region of mouse GFAP gene was cloned in the antisense orientation to PLXSN,a retrovirus vector.The recombinant expressing vector was named as PLBskG.The efficiency of PLBskG on the growth,cell cycle,morphology and GFAP gene expression of normal and reactive astrocyte in vitro was investigated by cell growth curve,flow cytometer immunocytochemistry,in situ hybridization,RT-PCR,Southern blot. Results The sequence and the orientation of GFAP cDNA fragment inserted into PLBskG was completely accuracy.The PLBskG was successfully conformed into PA317 cell and expressed in NIH3T3 cell as showed by Southern blot and RT-PCR analyze.The PLBskG infection resulted in growth suppression and G1 stage arrest of the normal and scratched astrocyte.The normal and reactive astrocytes infected by PLBskG became r[1] [2] [3] 下一页
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