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胶质细胞源性神经营养因子在成年大鼠背根节分布的免疫组织化学研究 |
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依次灌注生理盐水100ml、4%多聚甲醛/0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)500ml,取L4、L5背根节，于上述固定液中后固定8h。经梯度酒精脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，进行连续冠状切片(厚5μm)，切片隔3张取1张，分4套收集，裱于经APES防脱片剂处理的载玻片上。
2. 组织化学染色
切片经脱蜡处理后，入0.01mol/L PBS(pH7.4)。分为实验组和对照组。取第1套片子行免疫组织化学染色，其步骤如下：切片经0.3%双氧水，室温孵育30min；5%正常羊血清，室温孵育1h；兔抗GDNF血清(1∶500，Santa)，湿盒中孵育，室温24h;Biotin标记的羊抗兔IgG(1∶200,Vector)，室温孵育2h；ABC复合物(1∶200,Vector)，室温孵育1h。以上各步骤之间均用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗片，5min×3。最后用0.05%DAB-0.01%双氧水-0.01mol/L PBS呈色。常规脱水、透明、封片。取第2套片子做空白对照实验。以0.01mol/L PBS(pH7.4)代替一抗血清进行免疫组织化学反应。取第3套片子做替代实验，以与一抗血清同浓度的正常羊血清代替一抗血清进行免疫组织化学染色。取第4套片子行尼氏染色，以便对照观察。
3. 图像分析
利用北京航空航天大学图像中心研制的CMIAS-多功能真彩色病理图像分析系统对免疫组织化学结果进行图像分析处理。
结 果
对照组的实验结果均为阴性。
实验组切片经GDNF免疫组织化学染色后，可见成年大鼠L4、L5背根节中大部分神经元呈免疫反应性(图1、2)，免疫物质呈棕褐色，密集于神经元胞浆中；胞核位于细胞中央，染色结果为阴性，核仁无阳性染色。
图1 成年大鼠背根节GDNF样免疫反应 ×40
Fig.1 GDNF immunoreactivity(IR) in DRG of rat. ×40
图2 成年大鼠背根节中GDNF样免疫反应性神经元 箭头示免疫反应神经元 *示免疫阴性神经元 ×200
Fig.2 GDNF IR neurons in DRG of rat.arrow:positive neurons *,negative neurons ×100
免疫阳性神经元中，几乎所有的小神经元均为强阳性染色，而大神经元仅呈弱阳性反应(图3)，经图像分析显示：小神经元平均直径为24.08±6.88μm，平均光密度为0.15±0.03；而大神经元的平均直径为40.12±7.82μm，平均光密度为0.11±0.02，两者有显著差异(附表)。
附表 成年大鼠背根节细胞GDNF免疫染色结果的图像分析
Table Imaging analysis of GDNF immunostaining of the cells in the dorsal root ganglia of the adult rat
切片数
number of slides 细胞个数
number of cells 数密度()
quantity density 平均直径
(,μm)
averaged diameter 平均光密度
()
averaged optical
density
背根节强阳性细胞
strongly positive cells of DRG 8 816 0.000 132±0.000 138 24.08±6.88**
0.15±0.03**
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