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建立阿尔茨海默症的转基因动物模型 |
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1.转基因片段的制备
含有全长突变的人APP cDNA695 V717I受控于PDGF启动子调控的质粒pPDAP695由本课题组构建［5］。质粒pPDAP695的Tth111I+XbaI的酶切片段为4.1kb，透析袋法进行回收。氯化铯超离纯化，于20℃、40 000r/min离心48h。分步收集，将含有DNA的溶液合并，在注射缓冲液中透析。注射缓冲液含7.5mmol/L Tris(pH7.4)与0.175 mmol/L EDTA。
2.转基因操作
2.1 限制性内切酶及主要生化试剂：限制性内切酶及Tap DNA聚合酶购于Promega公司及华美生物工程公司。一般化学试剂均为国产分析纯。乳酸钠、透明质酸酶、矿物油、BSA等均购于Sigma公司(embryo tested)。孕马血清(PMS)购于天津市华孚高新生物技术公司，人绒毛膜促性腺激素(HCG)为上海生物化学制药厂生产。
2.2 动物品系：种公鼠为BDF1，10周龄以上。供卵鼠为KM，4～5周龄，体重12～16g。结扎公鼠为KM／ICR，10周龄以上。受体鼠(假孕鼠)为KM／ICR,8周龄以上，体重30g以上。
2.3 主要仪器：倒置显微镜(Nikon)、显微操作系统(NARISHIGE)、解剖镜(Nikon)钟表镊(Swiss)、CO2孵箱、DNA合成仪(PE480)。
2.4 超排卵和取卵：供卵鼠于明暗循环的明循环中点腹腔注射PMS 10 IU,46h后注射HCG 10IU，并与公鼠合笼，次日晨将有阴栓的母鼠处死。取输卵管在膨大部划出卵团，加透明质酸酶消化，挑出受精卵于M16继续培养4h。
2.5 显微注射GD-1管在水平拉针仪(MODEL PN-30,NARISHIGE JAPAN)拉成注射针。拉针条件：HEATER LEVEL：70.4，MAGNET SUB：22.1，MAGNET MAIN：59.6。注射针末端虹吸DNA溶液后，于400倍镜下注入受精卵雄性原核。注射浓度2mg/L。
2.6 移卵：受精卵注射后在M16继续培养2～4h，挑选生长状态较好的卵，进行移卵。每只假孕鼠输卵管单侧移卵约30枚。
3.转基因鼠的鉴定及传代建系
3.1 提取鼠尾DNA：仔鼠乙醚麻醉后，剪1.0～1.5cm鼠尾，在裂解溶中剪碎后，加蛋白酶K消化过夜。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀、漂洗，晾干后加150μl TE溶解。
3.2 鼠尾DNA的PCR检测：取1～2μl鼠尾DNA进行PCR反应。本实验共设计两对引物，分别位于转基因片段的5’端和3’端(图1)。
图1 APP 695转基因构建及PCR引物设计图
Fig.1 Construction of APP 695 transgene and design of PCR primers
P1为5’-GTCACCCCTAGTTCTTTTT-3 ,P2 5 -GGTAGACTTCTTGGCAATAC-3 ,PCR循环：94℃5min预变性；94℃ 1min,57℃1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延长10min。
P3为5’-GGTGGGCGGTGTTGTCAT-3 ,P4为5’-ACCTCCCCCTGAACCTGAAA-3’，PCR循环：94℃ 5min预变性；94℃30s，57℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃延长10min。
3.3 PCR-Southern P3、P4引物对扩增产物选用DIG高效随机引物标记与检测试剂盒I(B.M.)进一步检测。
3.4 转基因鼠建系 首建鼠与C57BL交配，产生F1代。F1代阳性鼠同窝互交，在F2代检测纯合子。
4. 病理学检查
标本经4%中性甲醛固定，常规石蜡切片，免疫组织化学采用ABC法。ABC试剂盒为VECTOR公司产品，一抗为小鼠抗人Aβ单克隆抗体，1∶200倍稀释。
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