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神经酰胺介导粒细胞凋亡机理初探 |
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分子参与调节细胞的生长,分化,特别是在介导细胞凋亡中的意义已引起人们的关注［2］。HL-60细胞是人早幼白血病细胞,但适当因子刺激(如PMA)可发生成熟性分化［3］,且具有较高强度的自发生成氧的活性,使其具有一定的原始粒细胞特点,因此我们拟用HL-60细胞及成熟中性粒细胞为模型,观察加入外源神经酰胺及胞内神经酰胺诱导剂的情况下,对其凋亡产生的影响,探讨其在粒细胞发生过程中可能的调节作用,以新的角度认识炎症的发生和调控机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和器材 C2-ceramide(N-acetyl sphingosine), 1,2-Diacylglycerol,佛波脂(PMA), 长春新碱(Vincristine)及碘化丙啶(PI)均购于Sigma公司; TNFα为邦定公司产品,AMV逆转录酶,DNA聚合酶为芬兰Finnzymes公司产品, bcl-2 cDNA克隆质粒pSBC2(阳性对照)由德国Dr.W.Dirks惠赠。流式细胞仪为美国B-D公司FACS Calibur，基因扩增仪为Biotechs公司HS-97型。
1.2 人外周血PMA分离 取健康献血者抗凝血, 按常规方法立即进行PMA分离。
1.3 细胞培养 1×106 ml-1 HL-60细胞及分离的人外周血PMA,基础培养条件为RPMI 1640培养液中含10%新生牛血清,青链霉素各100 U/ml,37℃含5% CO2 孵箱培养。
1.4 细胞基因组DNA提取及电泳 1×106 ml-1细胞按常规方法提取基因组DNA,电泳条件为1.8%琼脂糖凝胶,80 V电泳3 h, EB染色, 紫外透射下观察,拍照。
1.5 细胞总RNA提取 采用Chomozyrski异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法［4］ 。简言之, 准确计数细胞, 按5×105 ml-1加入变性液(异硫氰酸胍4 mol/L, 柠檬酸钠25 mmol/L, Sarkosyl 0.5%, β-巯基乙醇0.1 mol/L pH7.0)水饱合酚, 氯仿/异戊醇49:1, NaAc 2 mol/L pH4.0, 冰浴, 离心, 异丙醇沉淀, 真空干燥, 加10 μl DEPC*H2O溶解待用。
1.6 半定量RT-PCR测定bcl-2, c-myc mRNA表达 Oligod T18为引物, AMV作用下合成cDNA,反转录体系为20.0 μl, 含10×反转录缓冲液2.0 μl, Oligod T 18 1.0 μl(50 pmol), 4×dNTP 4.0 μl(2.5 mmol) RNasin 0.5 μl, RNA 5.0 μl, 逆转录酶4 U,42℃孵育60 min, 98℃ 3 min后, 取5.0 μl进行PCR。
分别合成bcl-2扩增引物 P1 5′GGACAACATCGCCCTGTG3′, P2 5′AGTCTTCAGAGAACAGCCA-
GGA3′, c-myc扩增引物P3 5′CAAGAGGCGAACACACAACGTCT3′, P4 5′AACTGTTCTCGTCGTTTCCGC-
AA3′,内参照β-action扩增引物P5 5′GCGGGAAATCGTGCGTGACATT3′；P6 5′GATGGAGTTGAGGTAGTTTCGTG3′［5，6］,扩增片段分别为137,218,234 bp,50 μl扩增体系中含10×扩增缓冲液, 上下游引物各50 pmol, 4×dNTP(400 μmol)，耐热DNA聚合酶0.5 U。93℃ 变性3 min后,按93℃ 35 s、55℃ 50 s、72℃ 55 s 32个循环, 72℃延伸5～10 min。10 μl PCR产物以2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.4 μg),100 V电泳20 min。紫外灯下鉴定结果。
1.7 流式细胞仪测定细胞凋亡 离心收集细胞(2×106 ml-1), 70%乙醇处理18 h, 离心弃上清, 少量PBS溶解细胞沉淀,加RNase(100 μg/ml), 37℃ 30 min,室温下PI(50 μg/ml)染色30 min, 流式细胞仪检测, 通过观察细胞周期变化及亚二倍体峰的出现来确认细胞凋亡及比例。上一页 [1] [2] [3] 下一页
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