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可溶性HLA |
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样本 113例正常献血员外周血分离的血清。
1.2 材料 W6/32单克隆抗体(W6/32 mAb，0.5mg/ml，Accurate Chemical & Scientific，已纯化并去除Fc片段)；兔抗人β2微球蛋白-辣根过氧化物酶(抗β2m-HRP，Accurate Chemical & Scientific)；sHLA-Ⅰ标准品(HLA-B7，0.5 mg/ml,Sangsart)。
1.3 方法 96孔酶标板经磷酸盐缓冲液(PBS，pH 9.6,0.05 mol/L)冲洗后，每孔加W6/32 mAb(10 μg/ml)100 μl，4℃作用18 h，再以洗涤液(PBST，pH 7.4，0.02 mol/L，含0.05%吐温-20)冲洗，每孔加1%牛白蛋白(BSA)-PBS，室温封闭1 h，再冲洗后备用。
sHLA-Ⅰ标准品以样本稀释液(0.25%BSA-PBS，含1 mmol/L Mg2+)稀释为 6.20、25.00、62.50、125.00 ng/ml，以W6/32 mAb室温中和(1∶1)2 h后为阴性对照，用稀释液作空白对照，每孔加样100 μl，37℃保温2 h后弃上清液并洗涤，再加兔抗人β2m-HRP(1%BSA-PBS 1∶1 000稀释)100 μl，37℃保温1 h，弃上清液并洗涤，加底物应用液(TMB)100 μl，37℃保温30 min，加2 mol/L硫酸50 μl终止反应，然后5 min内以酶标测读仪(双波长450 nm/630 nm)测定吸收光值(OD)，根据sHLA-Ⅰ标准品不同含量的OD值，以半对数座标纸绘出标准曲线，计算出回归方程中a、b值及相关系数r，由公式X＝e(Y-a)/(b)计算被检血清sHLA-Ⅰ准确含量。
被检血清作1∶25稀释后按上述方法测定sHLA-Ⅰ含量。
2 结果
2.1 sHLA-Ⅰ标准品含量为6.20、25.00、62.50、125.00 ng/ml时，OD值分别为0.263、0.795、1.132、1.399，阴性对照为0.020，绘出标准曲线如图1所示。sHLA-Ⅰ含量的对数与OD值呈线性相关，统计学分析相关系数r=0.999 7，回归方程为Y＝-0.420+0.340 LnX，X=e(Y+0.420)/(0.340)，据样品OD值精确计算sHLA-Ⅰ含量的回收率为96.77%～103.40%。根据阴性孔的均数±2倍标准差，以8次阴性孔OD值计算最小检出量为3.69 ng/ml。
2.2 特异性：以W6/32 mAb、血红蛋白液、人免疫球蛋白、BSA等替代被检血清试验，重复3次OD值为0.020～0.047，分析结果为阴性。
2.3 竞争阻断试验：在加入sHLA-Ⅰ标准品后，先加不同量兔抗人β2mmAb(0.2、1.0、2.0、4.0 μl)，再加抗β2m-HRP，OD值随兔抗人β2mmAb量增加而降低(0.812、0.517、0.292、0.223)；先加不同量鼠抗人血型抗原A后(0.2、1.0、2.0、4.0 μl)再加抗β2m-HRP，OD值无明显降低(1.065、1.042、1.030、0.935)。
2.4 3批被检血清分别重复8孔，结果为605.00±33.25，327.50±24.00，249.75±13.25 ng/ml；3批血清2 w内重复5次，结果分别为643.00±65.75，397.50±29.75，224.00±14.75 ng/ml，计算出批内变异系数为5.3%～7.4%，批间变异系数为6.6%～10.2%。
图1 sHLA-Ⅰ测定标准曲线
Fig.1 Standard curve for quantification of sHLA-Ⅰ antigens
2.5 113例正常献血员sHLA-Ⅰ含量为789.27±506.32 ng/ml。
3 讨论
HLA-Ⅰ基因位于第6号染色体短臂，含8个外显子，其中第5外显子编码跨膜区，当这段基因缺失或在RNA水平上变位剪接去除后，便产生分泌型HLA。检测sHLA-Ⅰ的方法有细胞毒抑制试验、一维等电聚焦聚凝胶电泳(ID-IEF)、流式细胞仪(FACS)上一页 [1] [2] [3] 下一页
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