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3、G-CSF对凋亡的拮抗作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选择经骨髓形态学及组织化学、免疫组织化学分型(按白血病国内诊断标准)确诊的未治疗者，M1 2例、M2 10例、M3 4例、M4 14例、M5 4例。
1.2 实验方法 取肝素抗凝骨髓5 ml，用Ficoll(上海试剂二厂)分离单个核细胞，用15%FCS(华美产品)、RPMI 1640培养液(GIBCO产品)调整细胞浓度为1×107 ml-1，置24孔培养板(丹麦NUNCLON)中。用RPMI 1640配制Ara-c溶液(上海联华制药厂)，加入Ara-c组培养孔中，使各孔终浓度分别为10、100、1 000 μg／ml。IL-3+G-CSF组和G-CSF组则再加IL-3(上海源东产品)，使其终浓度为1×104 U／ml。Ara-c组加入等量的RPMI 1640，37℃ 5%CO2培养24 h。
形态学观察：收集培养细胞，离心涂片，Wright-Giemsa染色光镜下观察计数300个细胞，发现有核固缩、染色体凝聚和凋亡小体形成等特征，为凋亡细胞，并计算百分率。
细胞DNA电泳：分别收集各组含100 μg/ml Ara-c 孔的细胞。PBS洗涤2次，用Sep Genen DNA提取试剂盒(Promega产品)提取DNA。紫外分光光度计定量后，取样与加样缓冲液混合后，10%聚丙烯凝胶电泳，银染观察。
蛋白印迹免疫检测：分别收集各组含100 μg/ml Ara-c孔的细胞。PBS洗 3 次，用1 ml细胞溶解液溶解(2%SDS，0.15 mol/L NaCl， 10 μmol Tris，1 mmol/L EDTA)4℃ 30 min，用总蛋白测定试剂盒(Sigma)分光光度计测定含量，每份取50 μg，煮沸变性于10% SDS-PAGE电泳，电泳后电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，并用封闭液(1%脱脂奶粉，0.01%Antifoam A， 0.02%叠氮钠)封闭2 h后，与Bcl-2单抗(1∶100，DoKo)孵育3 h，PBS洗3次，每次10 min，加入二抗为HRP-抗鼠IgG抗体(1∶1 000，华美产品)，室温下轻轻振荡1 h，缓冲液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L TrisCl，pH7.5)洗 3 次。用二氨基联苯胺(DAB)显色。
2 结果
2.1 凋亡细胞形态学观察 见表1。Ara-c组随Ara-c浓度升高，凋亡细胞增多，1 000 μg/ml时凋亡细胞达(45+6.2)%。G-CSF能拮抗低剂量Ara-c诱导的凋亡，但不能完全拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。IL-3+G-CSF能拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。
2.2 DNA凝胶电泳 Ara-c组(100 μg/ml)34例均发生DNA断裂，形成以200 bp左右为最小单位的典型DNA“梯形”图像。G-CSF组34例仅17例见到DNA“梯形”电泳图像，明显少于Ara-c组。IL-3+G-CSF组34例中9例见到较典型DNA“梯形”图像，明显低于前两组，见图1。对照组34例中未见DNA“梯形”图像。
图1 Ara-c诱导的白血病细胞凋亡
Fig.1 The apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c
Note:1.DNA marker;2.Ara-c(100 μg/ml);3.G-CSF+Ara-c;4.IL-3+G-CSF+Ara-c
2.3 Bcl-2基因表达 对照组32例出现深棕色的Bcl-2表达蛋白带。Ara-c组19例存在染色变浅的表达蛋白带。G-CSF组26例出现Bcl-2表达蛋白带，其中大部分染色变浅。IL-3+G-CSF组24例存在Bcl-2表达蛋白带，表现同G-CSF组，见图2。
图2 蛋白印迹免疫法显示Bcl-2表达
Fig.2 The expression of Bcl-2 by immunoblotting
Note:A：1,3.control group;2.Ara-c(100 μg/ml);4.G-CSF+Ara-c;5,6.IL-3+G-CSF+Ara-c；B：the content of β-ac上一页 [1] [2] [3] 下一页
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