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一种可同时检测抗双链和单链DNA抗体的快速斑点免疫金渗滤试验 |
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1.2 血清标本 确诊的SLE病人50例；混合结缔组织病(MCTD)10例；类风湿性关节炎(RA)15例；硬皮病(PSS)12例；干燥综合征(SS)8例；多发性肌炎(PM)和皮肌炎(DM)14例；慢性肝病(CLD)20例；正常人200例，常规取静脉血，分离血清。
1.3 ds-DNA的提取及生物素标记 见文献［1，2］。
1.4 ss-DNA的制备 取CT.DNA 10 ml、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，在4℃连续搅拌24 h，待完全溶解后，置100℃水浴10 min，再迅速转移至冰浴中冷却，放4℃备用。
1.5 ds-DNA和ss-DNA抗原膜的制备 ds-DNA抗原点的制备见文献［2］。在膜的另一处用ss-DNA(50 μg/ml)直接点样。在ds-DNA和ss-DNA两点之间，包被一杠状的人IgG(100 μg/ml)，2%BSA封闭。
1.6 抗ds-DNA和ss-DNA抗体检测盒的制备 参见文献［3］。
1.7 胶体金标记SPA的制备 参见文献［4］。
1.8 DIGFA检测方法 见文献［3］。结果判断：反应孔内出现一红色杠和两个斑点：抗ds-DNA阳性或抗ds-DNA和ss-DNA均为阳性；出现一红色杠和一个斑点：单项抗ss-DNA阳性；只出现红色杠：抗ds-DNA 和ss-DNA均为阴性；无任何显示为检测无效。
1.9 ELISA法测抗ds-DNA和ss-DNA抗体 按试剂盒的操作说明书进行。
2 结果
2.1 中和试验 ds-DNA和ss-DNA抗体均阳性及单项ss-DNA抗体阳性的血清分别加入ds-DNA和ss-DNA，在37℃中和1 h，加3%聚乙二醇，离心沉淀，上清液再用DIGFA检测，结果两种抗体均阳性的血清用ds-DNA中和后，ds-DNA抗体变为阴性，ss-DNA抗体仍为阳性，而用ss-DNA中和后则二者均变为阴性。单项ss-DNA抗体阳性的血清只能被ss-DNA中和。
2.2 稳定性和重复性试验 检测盒分置4℃和室温保存，每隔1 w检测同一份抗ds-DNA和ss-DNA阳性的血清，结果4℃存放一年、室温半年，其结果均未改变。取强阳性和弱阳性血清各5份，分别重复测定5次，每次相隔1 w，测定结果也相同。
2.3 临床应用 用DIGFA检测了329份血清，结果见表1，在79例非SLE的自身免疫病人中，ds-DNA和ss-DNA抗体同时阳性的仅1例(1.2%)，ss-DNA抗体单项阳性17例(21.5%)；可见ds-DNA和ss-DNA抗体同时阳性一般仅见于SLE，而单项ss-DNA抗体阳性可见于非SLE的自身免疫病及少数正常人。
2.4 方法比较 各组血清标本同时用DIGFA和ELISA进行测定，结果见表1。DIGFA检测ds-DNANote:the digit in table indicated the positive number and positive rate(in brace)抗体的阳性率高于ELISA(经配对计数资料的t检验，P＜0.05)，DIGFA的特异性也优于ELISA。
表1 DIGFA和ELISA检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体结果
Tab.1 The result of detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies by DIGFA and ELISA
Group n DIGFA ELISA
Anti-ds-DNA
and anti-ss-DNA
Anti-ss-DNA
Anti-ds-DNA Anti-ss-DNA
SLE 50 31(62.0) 6(12.0) 27(54.0) 32(64.0)
MCTD 10 1(10.0) 2(20.0) 1(10.0) 3(30.0)
RA 15 0 4(26.6) 2(13.3) 5(33.3)
PSS 12 0 3(25.0) 1(8.3) 4(33.3)
SS 8 0 2(25.0) 1(12.5) 2(25.0)
PM/DM 14 0 4(28.6) 2(14.3) 5(35.7)
CLD 20 0 2(10.0) 1(5.0) 2(10.0)
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