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-Ser,RGDS)肽的抑制作用。以认识阻断血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体防治再狭窄的作用机制。
材料与方法
一、大鼠主动脉球囊内皮剥脱术［3］：
300～350 g雄性Wistar大鼠，0.6%戊巴比妥钠(50 mg／kg,ip)麻醉，将改良的2F Forgarty球囊导管从左颈总动脉插入至腹主动脉远端，充盈球囊后，在不同方向反复抽拉3次，剥脱主动脉内皮。假手术组除不插入导管外，其余操作同剥脱组。
二、血小板血浆制备：
将假手术及球囊剥脱术后3、10、21 d的大鼠(每组各5只)在乌拉坦(1.0 g／kg，ip)麻醉下，腹主动脉取血，3.8%枸橼酸钠抗凝，离心分别制备贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP,3500 r／min， 15 min)和富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP，1000 r／min， 15 min)，后者调至5×108 platelets／mL。
三、血小板与血管条孵育：
摘取假手术组和剥脱3、10、21 d各组大鼠主动脉血管条20 mg，分别置于灌流浴槽，内盛从健康大鼠制备的PRP 4 ml。每只动物血管浴槽分别为不含RGDS(生理盐水)和含有RGDS(0.1mmol／L)两管。37℃、体积分数为95%O2-5%CO2平衡下孵育60 min。
四、血小板聚集及血浆纤维蛋白原含量测定：
取上述各组动物PRP及离体血管孵育的PRP各200 μL，37℃预孵育1 min后，分别加入ADP 50μmol/L，孵育5 min。以PPP作对照管，按比浊法测定血小板聚集。亚硫酸钠法测定血浆Fg含量。
五、蛋白激酶C活性测定［4］：
取上述各组动物和离体孵育的PRP各20μL，加80μL测定液［mmol／L：Tris/HCl(pH 7.5)20,［32P］-ATP(18.5kBq)0.0125，Mg(NO3)26.25，CaCl2 1.25)，PS(Phosphatidylserine)12.5 mg／L，PKC底物蛋白62.5 mg／L］,30℃孵育5 min，加终止液(25% TCA液于2 mol/L乙酸中)100 μL终止反应，取30 μL点于P81ion exchange chromatographic paper上，75 mmol／L磷酸冲洗，凉干，加闪烁液，在液闪计数仪上测［32P］放射活性。同时作不加样品的空白对照管，实验管与空白管［32P］掺入的差值表示PKC活性(pmol/5×108platelets.min－1).
六、cAMP活性测定［5］：
取上述各组动物的PRP和离体孵育的PRP各3 mL，离心、低渗液洗脱去除残存红细胞，收集的血小板经过氯酸和KOH处理后，按试剂盒说明书以放射免疫法测定血小板cAMP含量。
七、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体免疫组织化学染色：
将洗涤后的上述各组血小板悬液滴加于明胶处理过的载片上，室温下静置30 min,4%多聚甲醛固定(4℃ 1h)后，采用间接法行常规免疫组织化学染色，所用抗体为一抗(抗CDW41)，二抗(兔抗鼠IgG1:1000稀释)。以TBS替代一抗作为空白对照。Leica 4550 IW图象分析仪，进行图象灰度扫描分析，每组以100个血小板的积分光密度作为定量指标。
八、材料：
Wistar大鼠由本校实验动物部提供；［γ-32P］-ATP(比活性111TBq/mmol)购自Du Pont NEN;RGDS肽、PKC底物蛋白、phosphatidylserine 等为Sigma Co.产品；cAMP放免药盒购自上海中医药大学；CDW41抗体及二抗购自军事医学科学院邦定公司；余为市售分析纯试剂。
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