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缺血预处置及磷酸肌酸对心肌缺血 再灌注羟自由基生成的影响 |
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血预处置［1，2］及外源性磷酸肌酸［8，9］对心肌的保护作用已有部分研究。但其作用机制尚不完全清楚。自由基是造成缺血再灌注损伤的重要原因，本文旨在观察缺血预处置及磷酸肌酸对心肌缺血/再灌注羟自由基生成的影响。
材料与方法
(一)、模型制备及分组；雄性Wistar大鼠体重200～250 g(黑龙江省肿瘤研究所提供)，采用Langendorff离体心脏灌流模型，预灌20 min后随机分组，Control组：继续灌注40 min；I40R组：缺血40 min后再灌120 s;PC1(preconditioning)组：一次预处置(缺血5 min再灌10 min)后缺血40 min再灌120 s；PC4组：四次预处置后同I40R；PCr组：用含PCr 10 mmol/L的灌流液灌注5 min后同I40R组；PCr+PC1组：一次预处置后进行PCr组的处理。
(二)灌流液及灌流条件：灌流液为Krebs-Hensleit缓冲液，组成为(mmol/L):NaCl 118.0，KCl 14.7，MgSO4 1.2，CaCl2 2.5，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25.0， Glucose 5.5，用超纯水配制。灌流前用体积分数为95%O2与5% CO2混合气按1.5 L/min向储液瓶内的灌流液中通气30 min，灌注压为8.8 kPa，灌流液维持在37℃。
(三)样品制备(参考Ondera等的方法［3］)：
1.冠脉流出液样品制备：由文献得知再灌注1～3 min自由基生成达高峰。因此于再灌注90 s开始接取冠脉流出液至再灌120 s。取1 mL流出液置于10 mL试管内，加入40 μL 100 μmol/L 2，4-DHBA作为内标，同时加入50 μL 0.5 mol/L HCl，10 mL乙醚。充分混匀120 s，然后静止分层，将乙醚层移至另一试管中。置于45℃水浴中使乙醚完全蒸发后，向试管内加入50 μL 0.5 mol/L HCl和32.5 μL流动相(80% 0.03 mol/L柠檬酸，0.03 mol/L醋酸；20%甲醇，经超纯水配制过滤脱气后使用，pH3.6)，将试管壁上的结晶状物彻底洗到试管底部，使其充分溶解并摇匀后取20μL注入，HPLC分析(色谱条件：色谱柱Licrosorb C18，检测敏度0.02 AVFS,检测波长315 nm,流速0.6 mL/min，检测数据用C-R3AID文件内部标准法定量计算)。
2.心肌样品制备：剪取心尖部心室肌200 mg,用0.42 mol/L HCLO4制成匀浆，再用1 mol/L KOH中和，6000×g离心15 min,取上清1 mL。
结果
DHBA(dihydroxybenzoic acid,二羟苯甲酸)含量值为测得2，3-DHBA与2，5-DHBA值之和。
(一) I40R组冠脉流出液及心肌中DHBA含量非常显著地高于对照组(见表1)。
(二) 预处置组DHBA生成非常显著低于I40R组，但非常显著高于对照组；PC1组DHBA含量非常显著高于PC4组(见表1)。
(三) PG、PC4、PCr及PCr+PC1组DHBA含量均非常显著低于I40组，非常显著地高于对照组，但PCr+PC1组与PCr组及PC1组间无显著差别(见表1)。
表1 心肌及冠脉搏流出液中DHBAs含量
Tab 1 Amount of DHBAs in coronary effluent and myocardium (nmol/g wet weight， ±s，n=7)
Group Myocardium Coronary effluent
Contro l0.625±0.015 0.0618±0.0020
I40R 10.904±0.245* 1.3986±0.0141*
PC1 5.954±0.104*▲ 0.6013±0.0114*▲
PC4 3.508±0.210*▲■ 0.2811±0.0162*▲■
PCr 5.160±0.254*▲ 0.5904±0.0336*▲
PCr+PC1 5.032±0.320*▲ 0.上一页 [1] [2] [3] 下一页
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