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牛磺酸对大鼠脑缺血再灌注损伤时细胞凋亡的影响 |
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Sigma)10 μL和20 μL，每组给药两次，于缺血前给1次，缺血再灌流12 h再给1次，对照组用相同体积的生理盐水，每组5只，用于FCM测定；另外每组4只，用于TUNEL染色。
3.TUNEL染色：使用德国BM公司原位末端标记盒，原理是应用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) 将荧光素标记dUTP连接于DNA片段3’-OH末端。切片经蛋白酶K(20 mg/L,Sigma)室温下消化15 min，再用甲醇配制的0.3%H2O2处理30 min，然后浸于TUNEL反应混合物中，37℃ 60 min，用TB缓冲液(300 mmol/L NaCl, 30 mmol/L sodium citrate)室温下孵育15 min终止反应，再用连有辣根过氧化物酶(POD)的抗荧光素抗体于湿盒中37℃孵育30 min，DAB显色。阴性对照采用标记液(无TdT)代替TUNEL反应混合物。
4.FCM测定：于缺血再灌流24 h断头取脑，取给药同侧海马分离单细胞［6］，固定后按TUNEL方法染色，FCM测定。
5.图像处理：使用德国Leica公司MD20图像分析系统，测定单位面积(mm2)阳性细胞核数。
结果
1.FCM测定：通过缺血前给予1 mg和2 mg两种剂量牛磺酸，于缺血再灌流24 h分离海马单细胞，经TUNEL荧光染色，对凋亡细胞数量、百分比及平均荧光强度进行测定，生理盐水对照组，凋亡细胞数为12.36%，1 mg治疗组为8.93%，2 mg治疗组为8.33%，治疗组与生理盐水对照组间有显著差别(P＜0.05)，但两种剂量之间无显著差别(见表1)。
表1 牛磺酸对脑缺血再灌流损伤中海马内凋亡细胞的影响
Tab 1 The effect of taurine on apoptosis in
hippocampus during ischemia-reperfusion injury
Control 1 mg 2 mg
Number of apop 1236±108 893±251* 833±143*
% 12.36±1.08 8.93±2.51* 8.33±1.43*
Fluo-density 26.30±2.34 25.00±2.58 23.50±1.52
n=5,*P＜0.05，vs control
2.TUNEL染色：在生理盐水对照组，缺血再灌流24 h，海马CA1区及顶叶皮层可见较多阳性细胞核，表现为核固缩，阳性信号局限在核内，染色质凝集，边聚，形成半月状或环状。1 mg及2 mg治疗组，海马及顶叶皮层阳性细胞数明显减少。阳性细胞核的计数显示Tau治疗组阳性细胞核数较对照组明显减少(见表2)，而两组之间无显著差别。
表2 牛磺酸治疗后缺血再灌流24 h脑内凋亡细胞数的变化
Tab 2 The changes of the number of apoptotic cells in brain at 24h
of ischemia-reperfusion after taurine treatment ()
Regions Control 1mg 2mg
CA1 18.43±2.01 12.63±2.69* 11.56±3.01**
PC 17.50±1.76 11.69±2.95* 10.44±2.10**
n=4;CA1:the sector of hippocampus; PC:parietal cortex; *P＜0.05，**P＜0.01, vs control
讨论
近年，研究逐步证实细胞凋亡是脑缺血再灌流损伤的重要形式之一，特别在迟发性神经元损害阶段［1］。在脑缺血后牛磺酸含量增高，可对抗谷氨酸(glutamate,Glu)等兴奋性氨基酸及Ca2+升高引起的神经元损伤［3，7］。本实验发现，在脑缺血再灌流中，给予Tau后，海马CA1区及顶叶皮层内凋亡细胞数量显著降低，1 mg及2 mg治疗组，顶叶皮层每平方毫米凋亡细胞数分别降至11.69及1上一页 [1] [2] [3] 下一页
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