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异丙肾上腺素致大鼠心肌坏死时心肌细胞核钙转运功能的变化 |
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、发育、增殖、坏死和凋亡等核功能也起重要作用。近年发现，胞浆的Ca2+进入胞核，主要是通过核膜上的钙泵和核IP3受体等核钙主动转运系统调节，而不是通过核孔被动摄取［1］。心血管疾病时，核钙转运系统的变化及其意义，目前均不清楚。本工作在异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)心肌坏死大鼠模型上，观察心肌细胞核被膜钙泵(Ca-ATPase)活性和核［45Ca2+］摄取的变化，以探讨心肌损伤时心肌细胞核功能紊乱的可能机制。
材料和方法
(一)材料与试剂：Wistar 大鼠由本校实验动物中心提供，isoproterenol、ATP-Na2、dithiothreiol(DTT)、phenylmethylsulfonyl fluride(PMSF)、phosphoenolpyrovate(PEP)、pyrovate kinase(PK)以及标志酶测定试剂购自Sigma Co., ［45CaCl2］为Amersham产品。其余试剂均为国产GR或AR级，所用各溶液均以超纯水配制。
(二)大鼠异丙肾上腺素心肌坏死模型制备：雄性Wistar大鼠，体重100～150 g，按Rona等方法略作改良复制ISO心肌坏死模型［2］。ISO组(n=20)动物每日上午皮下注射ISO(69 μmol/kg)1次，连续注射3 d。对照组(n=20)动物生理盐水代替ISO皮下注射。全部动物于末次注射后24 h，以20%乌拉坦 (l g/kg,ip)麻醉，动脉放血处死动物，收集血液，4℃分离血浆。采用生化自动分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，用硫代巴比妥酸比色法测定脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量。开胸取心脏，称重，取心尖部位用10%福尔马林固定用于病理学检查，其余心肌用于以下实验。
(三)心肌细胞核分离：参照文献［3］方法改进：大鼠心脏用冷TKM液冲洗(mmol/L:Tris/HCl 50.0,KCI 25.0,MgCl2 5.0,EGTA 1.0, DTT 1.0， PMSF 1.0,leupeptin 0.001,pH 7.4),剪碎后按1∶5(W/V)加入等渗匀浆介质(TKM含0.25 mol/L蔗糖和1.0 mmol/L EGTA)，内切式匀浆器低速(8 000 r/min)匀浆2.5 min,再经玻璃匀浆器匀浆，纱布过滤后离心(1 200×g, 10 min)，弃上清，将沉淀再匀浆和离心1次，加入1倍体积的含1.0 mol/L蔗糖-TKM液混匀，再加入3倍体积2.5 mol/L的蔗糖-TKM液，混匀离心，(120 000×g,60 min)后，收集沉淀即为心肌细胞核，于-70℃储存备用。采用Lowry法行蛋白质定量，二苯胺法行DNA定量。用原子吸收分光光度法测定钙含量。按文献方法测定下述亚细胞成分标识酶的活性：5’-核苷酸酶(肌质膜)、葡萄糖-6-磷酸酶(肌浆网)和琥珀酸脱氢酶(线粒体)［4～6］。用分离纯化的心肌细胞核进行下述实验。
(四)核Ca2+-ATPase 活性测定［4］：反应液为(mmol/L):KCl 100.0，histidine 50.0,MgCl2 5.0,PEP 3.3,PK 15U/mL,EGTA 0.1， pH 7.0,加入50μg蛋白质的核，终反应体积为1.0 mL。采用双复管测定。反应液中的Ca2+浓度为100～3 200 nmol/L，通过EGTA与Ca2+的缓冲体系控制，根据Bartifi的多元缓冲对计算方法确定［5］，然后用Fura-2(10 μmol/L)荧光测定法核对。37℃预温5 min后，加入2.0 mmol/L的ATP始动反应，孵育10 min。加入终止液2.5 mL终止反应，测定无机磷产量。Ca2+-ATPase 活性为总ATPase活性与Mg2+-ATPase活性之差。酶活性单位为nmol/min.mg蛋白质。
(五)核［45Ca2+］转运测定［4］：反应液为(mmol/L):KCl 125.0, HEPES 20.0, MgCl2 5.0, pH7.0, ATP 2.0, EGTA 0.1, ［45Ca2+］18.5 kBq, Ca2+浓度同Ca2+-ATPase测定，终体积0.5 mL。37℃预温5 min后通过加入0.2 mg蛋白质的核，始动反应，孵育一定时间后加入1mL 0.2mol/L MgCl2终止反应，在Millipore抽滤器上以0.45 μm微孔滤膜抽滤，用0.1 mol/L MgCl2冲洗3次。滤膜干燥后加入闪烁液，在β-液闪计数仪上测定［45Ca2+］放射性强度。同时做非特异摄入管，操作同上上一页 [1] [2] [3] 下一页
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