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抗菌肽D基因导入番茄及转基因植株的鉴定 |
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NOP)。其结构见图1：
图1 重组质粒Co24结构
1.CaMV 35S;2.AP-D gene clone site;3.NOP;
4.Spc＋/Str＋;5.AP-D gene。
1．1．2 植物材料 供试番茄（Lycopersion esculetum)品种为G－7，种子由广州市蔬菜科学研究所提供，常规方法种植和管理。
1．1．3 生化试剂 地高辛（DIG：digoxigenin）DNA标记与检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection Kit)为Boehringer Mannheim Co.产品，dNTP和Taq酶购自华美生物工程公司，其他试剂均为国产分析纯或优级纯。
1．2 方法
1．2．1 外源基因导入 采用花粉管通道法。在番茄开花授粉24～28h内剪去柱头，滴注载有抗菌肽D基因的重组质粒溶液(浓度为：0．1μg/μL)。标记好滴注过的花，结果成熟后收集种子。
1．2．2 胭脂碱检测 参照Otten等及许耀等的方法略为改进〔14,15〕。取幼嫩叶片于含有精氨酸及营养物质的固体培养基上培养24小时，用无水乙醇抽提胭脂碱，点样于滤纸，在甲酸∶乙酸∶水（12∶15∶63）电泳60 min，风干后用菲醌染色，再风干，紫外灯下对照标样观察。
1．2．3 转化植株DNA的提取 参照孙敬三〔16〕的SDS法略加改进。在将DNA沉淀溶于TE溶液后，用酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提一次， 再用氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提一次，然后用乙醇沉淀DNA，收集DNA溶于TE溶液，保存于－20℃备用。
1．2．4 PCR扩增程序与条件 模板DNA：转化植株与非转化植株总DNA；引物I（＋）：5＇GCTCGAGTGGAATCCATTCAAGGAATTG 3＇；引物II(－)：5＇CGAATTCTTAACCCTTGGCCAAGGCAGTAGCTTG 3＇。反应总体积为20μl。在95℃变性5min后，按93℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min 进行40个循环反应。以未转化植株为阴性对照，以转化用重组质粒为阳性对照。
1．2．5 DNA斑点杂交 将转化和未转化植株以及重组质粒的纯化DNA点在尼龙膜上，经预杂交后，加入DIG标记的抗菌肽D基因探针，按Sambrook等〔17〕的方法进行杂交和洗膜。探针制备:用转化质粒作模板，加入上述PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP(含DIG-dUTP)等，并按上述程序进行扩增。扩增结束后，按DIG KIT说明书进行DIG标记DNA产量检测。显色：按DIG DNA Labeling and Detection Kit（Boehringer Mannheim Co．产品）说明书进行。对照同PCR扩增。
1．2．6 Southern杂交 先将经限制内切酶EcoRI消化过的植株总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，后经HCl处理和碱变性，再按Sambrook等〔17〕的方法进行转膜、预杂交、杂交、洗膜和显色。探针的制备和DIG显色同DNA斑点杂交。对照同PCR扩增。
1．2．7 转基因番茄抗青枯病的鉴定 先将欲移栽的转基因番茄及未转基因的G－7之子一代幼苗（各50株）进行青枯假单孢菌（Pseudomonas solanace- arum Smith.;菌种由广州蔬菜研究所提供）浸根处理（菌液浓度为：1×108 cfu/ml）,然后，将处理过的幼苗种植在高发病的大田，观察记录植株的发病情况。
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