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基因体外随机突变的两种方法的研究 |
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结构改造和分子设计研究受到了这种认识水平的限制。目前，改善蛋白质性质的一种新的策略是：模拟蛋白质分子自然进化过程，在蛋白质的基因中引入随机突变，然后筛选出性质优良的突变体，这就是所谓的“进化蛋白质工程”〔1〕。大量成功的事实已表明这种策略的可行性。Halling P在对这项工作做评述时指出：就目前我们对蛋白质性质的分子基础的认识而言，利用这种策略来改善蛋白的性质是相当合理的〔2〕。进化蛋白质工程研究的第一步，就是要得到大量的蛋白质基因的随机突变体，然后从中筛选出有用的突变体。随着进化蛋白质工程研究的不断深入，在蛋白质的基因中引入随机突变的方法越来越多，从最初常用的基于PCR错误的随机突变，到DNA改组（DNA shuffling）以及错开延伸过程（staggered extension process）等〔3〕。这些方法都有效地将随机突变引入到蛋白质基因中，获得了大量结构各异的随机突变体，并从中筛选出许多优良性质的蛋白质，这些优良性质是蛋白质在自然进化过程中未能获得的，例如高稳定性、低抗原性等等性质。在本文中，我们将报道两种造成蛋白质基因随机突变的新方法，通过这两种方法处理嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶I基因，获得了大量结构各异的突变体，建立了突变体文库，从中可筛选比野生型酶性质更为优越的突变体。使得进化蛋白质工程研究领域又增加了两种新工具。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株和质粒
宿主大肠杆菌UM228（一种过氧化氢酶HPI－缺陷型突变体），由加拿大Mantoba大学P. C. Loewwen博士提供。携带野生型过氧化氢酶I基因 的质粒pUC19，由日本大阪大学生物工程系酵素工学研究室提供。
1．1．2 酶试剂及其它材料
由日本八洲药品株式会社华美公司等提供。
1．2 方法
1．2．1 具有耐热过氧化氢酶的菌落分析
将在LB〔4〕培养基（含50μg/ml氨苄青霉素）琼脂盘上37℃生长了20h 的菌落印到2号滤纸(Advantec Toyo Co,Tokyo）上。含菌落的滤纸放入被0.1mol/L磷酸钾溶液（pH7.0）浸过的空盘中。70℃加热10min后，用30％H2O2测定过氧化氢酶活性〔5〕。
1．2．2 过氧化氢酶热稳定性及酶活性测定〔5〕
分别携带含有野生型过氧化氢酶I及突变体突变基因质粒的大肠杆菌UM228，在含50μg/ml氨苄青霉素的2×TY培养基〔4〕中37℃培养22h后，40ml培养液的细胞离心后悬浮于2ml 0.1mol/L、 pH7.0的磷酸钾溶液中，超声波破碎后离心。上清液作为加热前的胞溶物。细胞破碎后70℃加热10min再离心得到的上清液作为加热后胞溶物。
上述两种上清液用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析，测定胞溶物中的过氧化氢酶蛋白浓度。根据该酶热变性导致其不溶或沉淀这一事实，过氧化氢酶热稳定性定义为加热后与加热前酶蛋白浓度的比值。因此。比值越低表示酶的热稳定性越低。
过氧化氢酶酶活性用分光光度法测定〔5〕。30℃，10μl胞溶物与3ml底物溶液（H0O2溶于0.1mol/L磷酸钾溶液中，浓度为20mmol/L，pH7.0）混合，立即在240nm处（H2O2浓度）测定光密度减少，酶活性定义为单位时间酶促分解过氧化氢的量（mmol/L.s），比活性为单位酶蛋白的酶活性（mol.H2O2/mol酶蛋白.s）。
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