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一个氨基糖苷类抗生素致聋家系线粒体DNA突变研究 |
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.1 DNA提取
取家系中所有成员（7人）及家系外一正常人的外周静脉血5ml，按常规方法提取总DNA(内含mtDNA)，作为PCR扩增反应的模板。
1.2.2 PCR扩增
以mtDNA nt 1 326～1 355及nt 1 684～1 704为引物,全部引物由上海生工(Sangon)公司合成。引物序列为5′－AGG TCA AGG TGT AGC CCA TGA GGT GGC AAG－3′(L链 1 326～1 355)；5′－GGT TTG GGT GAG GTG GAA TGA－3′（H链 1 704～1 684）。PCR反应体系含模板DNA 0.3μg，上下游引物各25pmol/L，dNTP 各为200,TaqDNA聚合酶2U，总反应体积为 50μl。PCR反应参数为94℃ 4min变性；94℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 45s 35个循环。以2％琼脂糖水平凝胶电泳观察聚合酶链反应结果。
1.2.3 PCRSSCP
取PCR产物5μl,加入等体积的变性液（98％甲酰胺 10 mmol/L EDTA,pH8.0，0.5g/L溴酚蓝，0.5g/L二甲苯蓝）98℃ 变性5min后立即置于冰水浴，上样后在15℃(电压200V)开始电泳。电泳后，7.5％乙酸固定10min，洗涤3次；加入1％的硝酸银染色20min，洗涤2次；再加入显色液（1.5％ NaOH，0.4％甲醛）显色，水冲洗后在读片灯上观察结果。
1.2.4 mtDNA序列分析
PCR产物经低熔点凝胶和WizardTM PCR纯化系统（Promega产品）,回收纯化后送大连宝生物工程公司进行自动测序。
2 结 果
2.1 PCRSSCP结果
家系中所有成员共7人，经PCRSSCP筛查，结果显示存在II2、II3、III1和III2 4例阳性标本，这些标本与正常对照比较，其单链DNA都出现了条带位置的相对移动(图2)。
图2 AmAn致聋家系的PCRSSCP检测结果
II2、II3、III1和III2 4例为突变个体。
2.2 mtDNA序列分析
为进一步确定突变的位置和性质，对SSCP检测为阳性的标本进行DNA测序，结果证实发生了mtDNA 1 555位点T→C的突变（H链）,对应L链为A→G的突变(图3)。
图3 AmAn致聋患者的mtDNA 序列分析
3 讨 论
家族性抗生素致聋现象在国内外均有报道，但对其遗传方式曾有不同的观点。Higashi在研究了两个日本家系和已报道的中国家系后，认为AAID是母系遗传（即线粒体遗传）〔1〕。1993年,Prezant等人通过对3个AmAn致聋家系的研究，首次报道患者与mtDNA 12S rRNA基因1 555位点A→G的点突变有关〔2〕,并且只通过母亲传递这种突变。空间结构分析和细胞生物学研究进一步证实了1 555点突变在AAID病因上的重要作用〔3〕。1996年,张丽珊等人也证实了Prezant的发现〔4〕。现对家族性抗生素致聋的研究证实有三种因素能够影响表型的改变〔5〕，这些因素都影响细胞中的氧化磷酸化水平。第一种是环境因素，其中AmAn的使用是由1 555位点突变导致耳聋的触发因素。有可能还存在其他尚未认识到的环境因素也起了相似的作用，比如影响氧基的形成与分离的饮食和药物。第二种因素是线粒体基因的影响，本研究和国内外众多资料都表明,线粒体基因第1 555位点突变是AmAn致聋的主要原因之一。1994年,Reid首先在一个苏格兰的AAID家庭中发现线粒体tRNASer(UCN) 7 445位点T→C的突变〔6〕。袁慧军等〔7〕通过对一个AAID家系的研究认为,mtDNA 1 555突变并不是AAID遗传易感性为唯一的分子基础。其他位点的突变也能导致AmAn致聋。第三个因素是细胞核基因，1996年,Guan等人〔8〕对一个AAID家系（此家系的所有成员都生活在同一个村落里相近的环境中，并且所有母系亲属具有相同的线粒体单倍体）中的听力正常和听力丧失的成员的成淋巴细胞的生化指标进行研究，发现生化指标存在着明显的差异。此研究证实了细胞核因素在疾病的发生过程中也起到了一定的作用。
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