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妊娠小鼠子宫内膜LIF基因表达的研究 |
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TT溶液2.5μl、10u的Rnase抑制剂，加无菌重蒸水至25μl。
1.3.2 主混合物2 RT-PCR缓冲液，含镁10μl,TitanTM酶混合物1μl加无菌蒸溜水至25μl。
1.3.3 cDNA合成和PCR扩增 将主混合物主混合物2加入同一PCR反应管中，混匀，放入PCR仪50℃30min进行cDNA合成。再按下列条件作40个循环的PCR扩增：94℃变性1min，55℃退火30s，68℃延伸3min。在对各实验组进行检测时，均设具有LIF基因表达阳性的小鼠子宫内膜和空白管为对照，以防出现假阴性和假阳性。
1.3.4 电泳 用6％聚丙酰胺垂直电泳，150V，22mA，50min，扩增DNA片段为538bp。
2 结果与讨论
实验结果表明，在妊娠第4天小鼠中，有19只子宫内膜LIF基因为强阳性表达，1只为弱阳性表达；妊娠第7天的小鼠中，1只为强阳性表达；4只为弱阳性表达；而妊娠第10天的小鼠中，仅检出1只小鼠有LIF基因弱表达(见图1)。
图1 小鼠子宫内膜RT-PCR聚丙烯酰氨凝胶电泳
1和2.显示538bp处弱阳性带；3.Mark(pBR322 MSP1)；
4.显示538bp处阴性带；5.显示538bp处强阳性带。
现已证实，LIF是胚胎着床及胚胎早期发育所必需的重要细胞因子，哺乳动物受孕过程中一个关键的步骤就是胚泡着床，胚泡成功的植入有赖于发育中胚泡和子宫内膜的相互作用。尽管植入的机制尚未详细阐明，但越来越多的证据证明，LIF在早期妊娠中的母胎界面发挥着重要的作用。LIF基因在小鼠子宫内膜的表达具有极强的时段性。Bahtt曾用LIF基因探针印迹杂交分析，未检测到LIF基因表达，而在受孕第4天(着床期)的小鼠子宫腺上皮细胞中检测到大量的LIF mRNA转录，当胚泡着床延迟时，LIF mRNA转录的峰值也随之延迟，并与着床时间保持高度一致〔2〕。
我们的实验结果表明，在所检测的20只妊娠第4天的小鼠子宫内膜中，有19例的LIF基因表达为强阳性，与其他学者的研究报道一致，仅1例为弱阳性表达，Shenmm Leder P曾利用RNA酶保护法及免疫组化技术检测到非孕鼠的动情期和动情后期I是LIF表达的高峰，而这两个时期恰是卵巢合成17β雌激素和孕激素的峰值期，这揭示LIF在子宫内膜表达的峰值与卵巢激素合成峰值相关〔3〕。对本实验妊娠第4天LIF基因本该强阳性表达但却弱表达的现象我们作如下解释：一是由于个体差异使其卵巢17β雌激素和孕激素未达到正常的峰值而影响了LIF基因的表达强度，也可能是胚泡着床延迟造成LIF基因表达峰值的延后。
有学者对妊娠第5天的小鼠子宫内膜LIF基因表达进行了Northern blot杂交分析，未检测到杂交信号，他们认为LIF基因表达终止〔2,4〕。但我们的实验却发现在20只妊娠第7天的小鼠中，有1只小鼠LIF基因为强阳性表达，4只为弱阳性表达，我们认为这可能仍然与个体体内17β雌激素和孕激素表达水平或胚泡着床时间差异有关，这也从另一个侧面反映了小鼠胚泡着床的时间和卵巢17β雌激素和孕激素合成的峰值期在不同的个体中存在差异，从而造成小鼠子宫内膜LIF基因表达时间的差异。至于本研究在妊娠第10天的1只小鼠子宫内膜中检测到LIF基因的弱表达，这可能与个体之间的差异有关。
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