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转基因细胞系CHL |
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1．细胞系：中国仓鼠CHL细胞,为本实验室保存。
2．质粒：Bluescript M13-为Stratagene公司产品，真核细胞表达载体pREP9，由美国Georgetown大学Dr.J.H.Luo赠送，长10 500 bps，在多克隆位点两侧带有启动重组基因高效表达的罗氏肉瘤病毒长末端重复序列（RSV-LTR）和neo选择标记，以及分别在大肠杆菌和真核细胞中繁殖的复制起点ColE1和OriP。
3．菌株：大肠杆菌JM109、TOP10。
4．酶系和试剂盒：限制性内切酶、PCR所用试剂、随机引物等购自华美公司；AMV逆转录酶，T4 DNA连接酶，核糖核酸酶以及Taq Track Sequencing System购自美国Promega公司。
5．生化、化学试剂：细胞松弛素B（CYB）、黄曲霉素B1（AFB1 ）、杂色霉菌毒素（STC）等购自美国Sigma公司，环磷酰胺（CPA）购自上海第十二制药厂。 MEM培养基、G418、胰酶购自美国Gibco公司。小牛血清（特级）购自杭州四季青生物制品公司。α-32P-dATP，3 000 Ci/mmol(1 Ci=3.7×1010Bq)10 μCi/μl，北京亚辉公司产品。
6．实验组织标本：人肝组织取自手术切除的肝癌旁组织，剪成小块后放冻存管内，立即浸入液氮，尔后置-70℃保存备用。
7．引物设计：根据Gonzalez等发表的序列［1］，选择其编码区序列的5’端和3’端为起始端，设计长为30 bp, 32 bp的引物并分别引入KpnI, SalI酶切位点, 扩增片段长度为1 704 bp 。引物在上海细胞所合成。序列如下：
上游引物：5 -AAGATGGCTCTCATCCCAGACTTG-3 (30 bp)
下游引物：5 -AGTATAACAACAGACAATGAGAGAGC-3 (32 bp)
8. 人肝组织总RNA提取及RT-PCR扩增CYP3A4 cDNA:用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法［2］提取肝组织总RNA，经紫外分光光度计测定纯度、浓度，并经甲醛变性胶电泳鉴定其完整性。RT-PCR按本室已建立的方法进行［3］。
9. Bluescript M13-3A4重组质粒的构建：CYP3A4 cDNA片段经胶上回收后与Bluescript M13-T载体［4］连接转化感受态JM109菌，蓝白筛选筛选出重组质粒，用酶切图谱和双脱氧末端终止法以T3 、T7引物直接在重组质粒上进行双链模板部分测序分析鉴定重组子。
10. 重组表达质粒的构建：用KpnI, SalI酶切Bluescript-3A4，胶上回收CYP3A4 cDNA亚克隆入pREP9 的KpnI, XhoI 位点之间。所涉及的酶切、连接、转化、重组子筛选、质粒大量制备等方法参考文献［5］。
11．细胞转染及筛选：用改良磷酸钙介导法［5］。以含G418 400 μg/ml的MEM培养基筛选出抗性克隆,扩大培养，冻存备用。
12．双核细胞微核试验：方法参见文献［6］，细胞松弛素B（CYB）溶于DMSO至浓度3 mg/ml贮于-70℃；AFB1、STC以DMSO配制，贮于-20℃；CPA以无血清培养基配制。微核细胞的判断按Giaravino的修订标准进行，每个样本的1 000个双核细胞中的微核细胞数减去溶剂对照组的自发微核细胞数，作为诱发微核细胞数。实验结果用Kastenbaum-Bowmen法进行统计分析［7］。
结果
1.人肝组织总RNA纯度和完整性：从人肝组织提取的总RNA经甲醛变性凝胶电泳后可清晰见到18S及28S两条带,见图1A。
2.RT-PCR产物的电泳分析结果：PCR反应进行30个循环后取5 μl经1％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后，可见在2 027 bp前有一特异条带。根据分子标志计算其大小为1 654 bp［8］与预计产物大小相符。见图1B
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