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中国仓鼠肺成纤维细胞过氧化适应及其机理 |
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然不同，其详细机制尚未清楚。
又据报道H2O2能诱导易被修复的DNA链断裂，这种修复机制涉及多聚ADP-核糖基聚合酶（PARP）激活［6］，提示PARP激活有可能是对抗DNA断裂的过氧化适应机制之一。
本研究应用中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)，以H2O2为诱导剂，在细胞整体活力及DNA分子水平，通过对诱导适应的量效关系研究，建立过氧化适应模式，并进一步探讨过氧化氢酶（CAT）及PARP在适应中的遗传修饰作用。
材料与方法
1.细胞系：中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL)用含15％灭活小牛血清的EMEM（Gibco）培养液在5% CO2、饱和湿度及37℃条件下培养。
2.化学试剂：溴化四氮唑蓝(MTT)、Triton X-100、3-氨基苯胺(3-AB)均为美国Sigma公司产品;过氧化氢(H2O2)为浙江临安化工厂产品；内消旋肌醇购自中国政翔化学研究所。胰酶为美国Life Technologies公司产品；小牛血清(特级)购自杭州四季青生物制品公司。其他试剂均为国产化学纯以上。
3.H2O2处理：一定密度的CHL细胞加低剂量H2O2预处理1小时，换液，培养24小时，再予高剂量H2O2处理30分钟，收获细胞，采用台盼蓝排除试验测定细胞的存活率，同时检测细胞活力或DNA断裂。
4.细胞活力检测：参照Hansen MB等［7］建立的MTT法。
5.DNA断裂检测：采用Birnboim等［8］的FADU方法经适当改良。
6.CAT酶诱导试验和活性测定：细胞接种后24小时，加低剂量H2O2预处理1小时，以0.01 mol/L PBS预处理1小时为空白对照,换新鲜培养液，培养24小时,收获细胞。CAT提取液的制备参照Sawada M等［9］的操作流程,CAT活性的检测采用Aebi H［10］的测定方法。
7.DNA过氧化适应中PARP阻断试验：根据DNA过氧化适应－攻击较佳适应模式,在H2O2预处理（D1）后,PBS洗细胞2次,换新鲜培养液，同时分别加入2 mmol/L 3-AB（3AB1）或3 mmol/L 3-AB（3AB2）培养24小时,加入攻击剂量H2O2（D2）培养0.5小时,收获细胞,用FADU法测荧光强度。实验分8组为：空白组;D1组;D2组;D1+D2组;D1+3AB1组;D1+3AB1+D2组;D1+3AB2组;D1+3AB2+D2组。
8.统计处理：采用SPSS及STATISTIC软件包分析数据,两组计量资料比较采用t检验，多组计量资料比较采用方差分析。
结果
1.细胞活力水平的过氧化适应：根据H2O2与MTT A570的剂量效应关系（资料未显示），本研究H2O2预处理剂量选用小于9 μmol/L的无毒性浓度，攻击剂量选用TD50 9 000 μmol/L左右的浓度。
以台盼蓝排除实验为基础，表明以下各组的细胞存活率均在90％以上。在细胞整体活力水平，以0.09 μmol/L H2O2预处理后,再给予9 000 μmol/L的H2O2攻击,其A570比对照组高(P<0.05),而其他浓度预处理后，差别无显著性(P>0.05)（表1）。说明0.09 μmol/L H2O2预处理可以提高细胞对攻击剂量9 000 μmol/L的耐受性。MTT为终点指标的过氧化适应模式见表2。
表1 H2O2诱导CHL细胞在活力水平(MTT)的
过氧化适应反应
H2O2(μmol/L) 实测值
A570(±s) 预测值a
A570
预处理 攻击
0
0 0.650±0.040
-
0.09 0 0.617±0.061 -
0.9 0 0.637±0.078 -
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