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大鼠上涎核的传出神经纤维与翼腭神经节中的VIP |
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翼腭神经节(pterygopalatine ganglion)是颅脑副交感神经节中最大和最重要的一个神经节［1］，位于大鼠翼腭窝内，在三叉神经上颌支内侧。神经元主要集中于呈三角形节的头部，也有的分散在节尾部相连的神经纤维中［2］。节后神经纤维支配泪腺、鼻腔和腭的粘膜以及颅内外血管［3］。神经节细胞含多种神经活性物质，如胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)［4］、神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)［4，5］、多巴胺-β-羟化酶(dopamine-β-hydroxylase,DβH）［4］、甘丙肽(galanin,GAL)［6］和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)［7］。用秋水仙碱阻断轴浆运输后，翼腭神经节还出现少量SP和CGRP免疫反应性的神经元［4］。翼腭神经节含有相当数量的SP(Substance P)和CGRP(calcitonin gene-related peptide)免疫反应性神经纤维［4，8］。支配翼腭神经节的节前神经纤维来自脑干网状结构中的上涎核［9］，通过岩浅大神经、翼管神经支配翼腭神经节［9］。虽然已有不少对翼腭神经节进行逆行追踪的研究，但尚未见有关翼腭神经节节前神经纤维在翼腭神经节中的形态、分布以及节前神经纤维与何种性质节细胞形成联系的报道。为此我们利用顺行追踪结合免疫组织化学方法对此进行了研究。
材料和方法
1. 顺行追踪
1.1 动物准备：SD大鼠，15只，成年雄性，体重250±20g，1%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(40mg/kg)，待完全麻醉后将其固定于立体定向仪上(江湾Ⅰ型，上海)，牙板低于耳杆3.3mm。准备上涎核立体定向注射。
1.2 顺行追踪剂及定向注射：将生物素-葡聚糖法(biotin dextran,BD；Sigma公司)溶于10mmol/L pH7.4的磷酸缓冲液中，配成终浓度为5%的溶液［10］。采用压力注射法将0.2μl的BD液缓慢地注射到左侧上涎核内。注射用微玻管直径约50μm，上涎核坐标为AP=-10.3mm、L=2.0mm、H=8.3mm［11］，整个注射过程约持续30min。注射完后留针10min，去针缝合皮肤。
2. 组织准备及切片制备
注射后12d，将动物用1%戊巴比妥钠过量麻醉，经升主动脉灌注生理盐水100ml，冲净血液，再用400ml 4%多聚甲醛(4℃)灌流固定，此步先快灌200ml，后慢滴200ml，共约1.5h，然后取材，将左侧眼部皮肤剪开去除眼球、泪腺、眼外肌及其他组织，暴露出左上颌神经，将上颌神经向下掀开，可见细长的翼腭神经节。分离出翼腭神经节，投入20%蔗糖液(0.01mol/L PB)4℃过夜，恒冷箱切片，将翼腭神经节切成相邻的6套切片，片厚13μm，贴于1%铬钒明胶处理过的载玻片上。
3. 追踪剂呈色反应及免疫组织化学双标
待翼腭神经节切片完全干燥后(室温下30min～1h)，切片进入0.01mol/L PBS 5min×3,0.3% Triton X-100 30min,0.01mol/L PBS 5min ×3,ABC(Sigma ABC Kit)室温下孵育8h后进行硫酸镍铵加强的DAB显色，显色完毕后进行免疫组织化学第2次标记，其方法步骤如下：将5套切片分别入抗-VIP兔血清(Incstar公司，1∶4 000)，抗DβH兔血清(Incstar公司，1∶2 000)，抗-NPY兔血清(本校组胚教研室，1∶2 000)，抗-SP兔血清(Watpa公司，1∶5 000)，抗CGRP兔血清(Oncogene Science公司，1∶5 000)。各套切片在一抗中孵育24h(室温)，二抗及ABC中各孵育3h(室温下)，0.01mol/L PBS清洗，进行DAB棕色反应(DAB 15mg用0.01mol/L PBS 100ml溶解后过滤，加葡萄糖200mg，氯化胺40mg混匀，临用前加葡萄糖氧化酶0.2mg)，镜检呈色合适，0.01mol/L PBS洗涤终止反应，第6套进行中性红复染，切片晾干、酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。
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