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抑制cyclinD1表达对乳腺癌细胞增殖及cyclinE CDK2和p21cip1转录的影响 |
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eased. The levels of cyclinE and CDK2 mRNA fell to a certain extent and expression of p21cip1 did not show apparent change. Conclusion The inhibition of cyclinD1 lessens abnormal cell proliferation of human breast cancer. The expressions of cyclinE and CDK2 as the genes in cell cycle control have close relationship with that of cyclinD1 while the expression of p21cip1 is not affected by cyclinD1.
【Key words】 Breast cancer; Cell proliferation; cyclinD1; CDK2; p21cip1
自从cyclin和CDK基因被发现后，对于它们在细胞周期调控中的作用已有大量深入的研究。现已证实，细胞周期的进程受到cyclin和CDK基因的调控，当cyclin与CDK的蛋白质产物形成有活性的蛋白激酶复合体时，便可启动细胞周期并且促进周期中不同时相的转换［1］。随着对细胞周期调控的研究，又发现了CDK抑制因子(CKI)的存在，这些因子能够与cyclin／CDK蛋白激酶复合体结合而抑制酶的活性。p21cip1是CKI中发现较早、作用较广泛的一种［2］。在对细胞周期调控机制研究的同时，人们意识到调控细胞周期的基因有可能在肿瘤细胞的发生与发展中起重要作用，正因为如此，近年来对于cyclin、CDK和p21cip1在肿瘤细胞中异常表达的研究受到广泛重视［3—6］。本研究中，利用cyclinD1反义RNA抑制此基因的表达，观察分析了cyclinD1受到抑制后，对人乳腺癌细胞增殖的影响，以及对同属于细胞周期调控基因的cyclinE、CDK2和p21cip1表达的影响。由此，不仅进一步探讨了cyclinD1与乳腺癌异常增殖的相关性，同时，分析了cyclinD1与其他细胞周期调控基因在表达上的关联。
材料和方法
1.细胞培养
人乳腺癌细胞系Bcap-37来自北京医科大学第二附属医院妇科肿瘤研究所。细胞培养基为PRMI1640加10%小牛血清，在37℃含5%CO2培养箱中培养。
2.cyclinD1反义RNA真核细胞表达载体的构建及细胞转染
本研究中所用的cyclinD1基因cDNA、CDK2基因cDNA由美国Cold Spring Harbor实验室的David Beach博士惠赠，cyclinE基因cDNA由美国Scripps研究所的Steve Reed博士惠赠，p21cip1基因cDNA由中国科学院水生生物研究所的桂建芳博士惠赠，真核细胞表达载体pXJ41-neo由新加坡国立大学王跃博士惠赠。用限制性内切酶E.CoRI将cyclinD1 cDNA从原质粒(puc118)上切下，并分离纯化，同时用相同的酶切表达载体pXJ41-neo，然后将cyclinD1 cDNA片段连接到表达载体中，利用cyclinD1序列和载体多克隆位点中HindIII酶切位点，筛选出表达反义RNA的重组质粒(图1)。细胞转染采用磷酸钙共沉淀法。
3.细胞生长曲线测定
取对数生长期细胞，将其密度稀释成104个／ml，于6孔板中培养，每24h取1次样，每次每个样品取3个孔的细胞，每个孔的细胞密度计数3次，计数后取平均数，连续测定6次样，并绘制成曲线。
4.流式细胞光度术分析
取对数生长期细胞，用75%乙醇固定过夜，PBS洗2次后加入RNaseA(100mg/L)37℃保温30～60min，用碘化丙啶(prpidium iodide,PI 50mg/L)在冰上避光染色30min，细胞经尼龙网过滤后，在自动流式细胞分析仪上测定。
5.Northern blot分析
采用硫氰酸胍-酚-氯仿法提取细胞总RNA［7］，在1.2%的甲醛变性琼脂糖凝胶中电泳，首先配制的凝胶在80V电压下预电泳5min，点样后将电压调至56V，电泳约1.5h时，将前后电极液适当混合，约3h结束电泳。在紫外光下迅速观察胶中各样的18S和28S rRNA带，判断RNA的完整性和样品量的均一性，并作为各样品的内对照。杂交探针是体外转录的各基因片段的反义R上一页 [1] [2] [3] 下一页
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