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卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv mGM |
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ured time. Fusion protein could specifically react with the primary anti-ovarian carcinoma monoclonal antibody(COC166-9) and rat anti-mouse GM-CSF monoclonal antibody, respectively, and fusion proteins could also stimulate murine GM-CSF dependent cell line NFS-60 cells to proliferate. Conclusion Fusion proteins 6B11mGM expressed as inclusion bodies can keep the activity of both the proteins and provid foundation to research the immunoreactions in vivo.
【Key words】 Ovarian carcinoma; Recombinant fusion proteins; Antibodies, Anti-idiotypic; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; Inclusion bodies
本中心曾用卵巢上皮癌可溶性抗原OC166-9免疫BALB／c小鼠，制备了单克隆抗体COC166-9。经免疫组织化学染色证实该抗体对卵巢上皮癌具有较高的特异性［1］。继而用COC166-9单抗免疫小鼠制备了内影像型抗独特型抗体6B11。经免疫竞争抑制试验证实，该抗体具有模拟卵巢上皮癌初始抗原OC166-9的作用［2］，可在体内外诱导产生特异的抗卵巢癌免疫反应［3，4］。为了降低鼠源性抗体反复在体内应用时可能引起的副作用，本中心对卵巢癌抗独特型抗体6B11进行改造，构建了单链抗体6B11ScFv［5］。改型后的抗体，虽降低了鼠源性，但同时因分子量减少，免疫原性也随之下降，应用时必须与匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)等偶联并加用佐剂才能引起有效的免疫反应［6］，而现在常用佐剂往往对人体有害。因此，有必要寻求一种新的佐剂。最近研究表明粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)等细胞因子与抗原构成的融合蛋白，可增加抗原的免疫原性［7］。为提高单链抗体6B11ScFv的免疫原性，使其能做为卵巢癌抗独特型疫苗，本中心已构建成功6B11ScFv与人GM-CSF融合蛋白(6B11GM)，并且体外实验已证实在抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)和树突状细胞(dendritic cell,DC)存在情况下，可诱导T细胞增殖，同时APC对6B11GM摄取明显高于单用6B11［8］。但由于目前缺乏合适的动物模型，使抗独特型疫苗的效果和机制难以得到体内实验的验证。因此，本研究构建6B11ScFv与鼠GM-CSF融合蛋白(6B11mGM)，目的在于进行体内外实验，为卵巢癌抗独特型疫苗6B11GM应用于临床打下基础。
材料和方法
1.质粒、细胞系
质粒pL／6B11ScFv-hGM-CSF由本中心构建。质粒pET30a(+)购自Novagen公司。质粒pTC-GM.2内含murine GM-CSF cDNA，由美国斯坦福大学Levy教授惠赠。pGEM-T Vector购自Prome-ga公司。鼠GM-CSF依赖株NFS-60细胞购自北京医科大学分子免疫学室。宿主菌E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司。
2.抗原、抗体和细胞因子
卵巢浆液性乳头状癌抗原OC166-9由本中心制备。HRP-COC166-9抗体、6B11单克隆抗体均为本室制备。大鼠抗小鼠GM-CSF单抗及重组murine GM-CSF购自美国R and D System。HRP-羊抗大鼠IgG购自Santa Cluz公司。
3.试剂
Tag酶、T4DNA连接酶及各种DNA限制性内切酶均购自美国Promega公司。MTT等生化试剂购自北京天象人公司和北京化学试剂公司。
4.鼠GM-CSF的PCR克隆
鼠GM-CSF位于pTC-GM.2质粒中，由于缺乏合适的酶切位点，依据融合蛋白6B11mGM的构建上一页 [1] [2] [3] 下一页
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