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散发性戊型肝炎病毒部分核苷酸序列分析 |
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>对阐明HEV毒株的地理分布，解释本病的流行特征，研制血清学诊断试制及基因工程疫苗均
具有重要的理论和实际意义。我们选择1例浙江仙居山区散发性HE患者，从其血清中分离HE
V RNA，通过逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)法，扩增该散发性HEV(Z-33株)ORF2区部
分cDNA片段(497bp)，然后进行直接序列分析，并与HEV各主要代表株序列作比较。
材料和方法
1.标本来源：1995年6月浙江仙居山区1例散发性HE患者发病第5天血清。该病例为男性，
30岁，临床诊断急性黄疸型肝炎，实验室检测血清抗-HEV IgM阳性(采用Genelabs公司EI
A试剂盒)，其它肝炎病毒急性感染的血清学标志物均为阴性，包括抗-HAV IgM、HBsAg、
抗-HBc IgM、HBV DNA、抗-HCV、HCV RNA、HDAg、抗-HD IgM、抗-CMV IgM及抗-EBV I
gM。
2.试剂和仪器：RT-nPCR扩增反应有关试剂和仪器见参考文献〔1，2〕。Wizard PC
R 产物纯化试剂盒为美国Promega公司产品，DNA序列分析试剂盒为英国Amersham公司产
品。序列分析仪和凝胶干燥仪由美国Bio-Rad公司生产。
3.HEV RNA提取：采用异硫氰酸胍一步法〔3〕。
4.RT-nPCR扩增：分别采用HEV缅甸株开放读码框架(ORF)1、2区域内的各2对寡核苷酸
作为引物(北京医科大学庄辉教授惠赠)，进行RT-nPCR扩增反应〔1〕。
5.HEV cDNA回收和纯化：采用Wizard试剂盒，对HEV ORF2 RT-nPCR扩增产物进行纯化，
操作按说明书进行。最后经0.7%琼脂糖凝胶电泳检查提取物纯度。
6.HEV cDNA序列测定：采用Sequence Version 2.0 DNA序列分析试剂盒，以同位素
γ-32P末端标记引物，经双脱氧核苷酸DNA链末端终止直接测序法，测定HEV ORF2 RT-nP
CR扩增产物的核苷酸序列。
结 果
1.RT-nPCR检测：该散发性HE患者血清中的HEV(Z-33株)ORF1及ORF2检测均为阳性(见
图1)。
2.序列测定：散发性HEV Z-33株ORF2部分核苷酸序列测定结果与HEV新疆流行株(CH1.
1)比较见图2。
3.核苷酸及氨基酸序列同源性比较：浙江仙居山区散发性HEV Z-33株与新疆流行株〔(C
H1.1)(Ep)〕、缅甸流行株〔HEV(B)(Ep)〕及缅甸散发株〔HEV(B)(Sp)〕的核苷酸序
列同源性分别为96.7%,94.2%和95.2%(见附表)。绝大多数核苷酸变异发生在碱基三联体
的第3位上。因此，该株与CH1.1(Ep)、HEV(B)(Ep)和HEV(B)(Sp)的氨基酸序列同源
性很高，分别达98.2%,99.1%和99.1%。Z-33株与墨西哥株〔HEV(M)〕的核苷酸及氨基
酸序列同源性分别为81.8%和94.5%。
图1 HEV Z-33株RT-nPCR法扩增结果
Fig 1. RT-nested PCR products of HEV Z-33 strain
M：100 bp DNA ladder
Lane 1:RT-nPCR products of HEV Z-33 ORF2(497 bp)
Lane 2:RT-nPCR products of HEV Z-33 ORF1(218 bp)
Lane 3:Blank control
Lane 4:Negative control
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