|
人类疱疹病毒7型DNA断裂包装位点序列分析 |
| |
posed of an arrangement of p
ac 2·X·pac 1,which was found in the junction from the head-to-tail conc
atamer that is generated during productive HHV7 infection.
【 Subject words 】 Human herpesvirus 7 Genes,viral Sequence an
clysis DNA,viral 1990年Frenkel等首次报道从一名健康成人的CD4+ T细胞中分离
到一株新的DNA病毒，命名为人类疱疹病毒7型〔1〕(human herpesvirus 7,HHV7)。
此后，又陆续有分离HHV7本课题受卫生部科研基金资助(编号96-2-099)
病毒株的报道〔２〕。血清流行病学调查显示约96%的成年人血中存在抗HHV7的抗体〔３〕。
大多数成年人在2岁左右时即可被HHV7感染，并且易形成潜伏性感染〔４〕。HHV7具有非
常独特的生物学特性，即对CD4受体具有高度趋向性和特异性。Lusso等报道HHV7的感染
能明显抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制〔５〕，因此，HHV7的研究将有助于进一步了解
艾滋病的发病机理，并有可能提供一种新的治疗艾滋病的方法。本文对HHV7 DNA末端的断裂
位点及包装信号进行了序列分析和报道，这将有助于利用HHV7构建新的艾滋病基因治疗载体。
材料与方法
1.HHV7及Sup-T1的来源：HHV7 JI株及HHV7 R2株及Sup-T1传代细胞系均由美国罗
彻斯特大学医学院Nanette Van Loon博士提供，HHV7 JI株分离自一位慢性疲劳综合征(c
hronic fatigue syndrome)患者，而HHV7 R2株分离自美国纽约罗彻斯特的一个正常成
人的唾液标本。Sup-T1分离自一名患非何杰金氏淋巴瘤的儿童血液中的未成熟T淋巴细胞，
为传代细胞系，已传27代。
2.HHV7 DNA的提取：将HHV7 JI株及R2株感染Sup-T1传代细胞系，37℃孵育2小时，
将已感染HHV7的Sup-T1细胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃培养14天，
收集含HHV7的培养上清液低速离心，去细胞沉渣，取上清液再高速(14000r/min)离心2小
时，去上清，将病毒沉淀物重悬。再加入STE(即氯化钠、Tris、EDTA缓冲液，其中加入R
Nase及蛋白酶K)消化后以苯酚、氯仿、异戊醇抽提，乙醇沉淀，低温真空干燥后重悬于TL
E(即Tris、EDTA缓冲液)中即获得线性HHV7 DNA。为避免自身环化，用T4-DNA聚合酶将其
粘性末端填平。另将细胞悬液离心，去上清，细胞沉块用PBS洗涤后用蛋白酶K消化，然后用
Lee & Rashad质粒DNA小量提取法提取环化的HHV7 DNA。
3.PCR扩增待测DNA片段：以部分已知的HHV7 DNA左右侧末端基因保守序列〔６〕为模
板设计1对引物：左侧引物(5→3)为GACCTAGGTTAGGGTTA
GCTCCCCCCCTTT，右侧引物(5→3)为GAGAAT
TCAACCCTAACCCCGCCCCCACT，在左侧引物中插入AvrⅡ酶切位点CCTAGG，在右侧引物
中插入EcoRⅠ酶切位点GAATTC，以利于克隆筛选。PCR于100μl容积中进行，其中含前
述方法制备的HHV7 DNA模板200ng，Mg++1.5mmol,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.
2mmol,左右侧引物各4μmol,Taq多聚酶(Promega)5单位，相应Taq酶10×缓冲液10
μl,按90℃60秒，60℃45秒，72℃45秒，35个循环进行扩增，扩增后进行凝胶电泳检测
扩增条带。
4.待测基因片段克隆：将PCR扩增后得到的待测DNA片段纯化，与pGEM-T(Promega)
质粒载体按3∶1的摩尔比在T4-DNA连接酶的作用下体外连接，热休克转上一页 [1] [2] [3] 下一页
上一个医学论文： 感染人体的博尔纳病病毒ORF 基因前部片段的检测
下一个医学论文： 散发性戊型肝炎病毒部分核苷酸序列分析
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 基础医学论文 >> 正文