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感染人体的博尔纳病病毒ORF 基因前部片段的检测 |
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感染动物的BDV的全基因组序列以后〔4〕，已开始陆续报道感染人类的BDV ORF Ⅱ(p23)
基因片段的检测结果〔5〕。1996年Sauder首次报道了检测感染人类的BDV ORF Ⅰ(40)基因中
间片段及测序结果〔6〕，但至今尚未见感染人的BDV ORF Ⅰ基因前部片段的检测的报道。我
们用套式逆转录/多聚酶链反应(nested RT-PCR)检测BDV感染的人体中周围血单核细胞(P
BMC)BDV ORF Ⅰ基因前部片段。
材料与方法
1.研究对象：日本福岛地区的5例精神分裂症和4例情感障碍患者以及3例健康献血者经
先前BDV ORFⅡ基因片段检测呈阳性证实已存在BDV感染。其PBMC中总RNA提取后-20℃保
存。
2.试剂：BDV-MDCK标准病毒株由日本北海道大学免疫学血清室提供。nested RT-PC
R药盒由日本Toyobo公司和美国Perkin-Elmer公司提供。PCR内外引物及生物探针均自
行设计，由日本Toyobo公司合成提供(附表)。
附表 PCR引物及探针碱基序列
Table. PCR primers and the base sequence of the probe
Rengent Base sequence(5～3) bp
Primer(inside) (1)
(2) ATGCCACCCAAGAGACGCCT
GCCGGTTTAAGGCTGCCATC 54～74
560～580
Primer(outside) (1)
(2) TTGATGACGCCGATGCCAT
TGATCTGCTCGGCTCCTGCT 77～95
520～540
Probe CGCCTGTTACGCGTGGGGAACAGA 361～384
3.nested RT-PCR：逆转录反应与第一轮PCR同 时进行。在25.5μl总反应体积中含
dNTP 3μl,MnCl 2.5μl,外引物1对各0.5μl，RNase酶活性抑制物1μl，Tth DNA聚合
酶1μl，该酶可逆转录RNA为cDNA和在PCR扩增时延伸引物，待测标本1μl。扩增条件：
60℃30分钟，94℃2分钟。然后94℃加热变性1分钟，延伸1.5分钟，循环40周期，后再
60℃持续7分钟。第二轮PCR：在25.1μl总反应体积中含dNTP 2μl,内引物1对各1μl，
Tth聚合酶0.1μl,第一轮PCR产物0.5μl。扩增条件：92℃加热1分钟。92℃变性50秒，
65℃退火1分钟，75℃延伸1分钟，共循环40周期。
4.PCR产物检测：取10μl第二轮PCR产物在1.4%的琼脂糖凝胶中电泳显带，并以碱性
磷酸酶标记的特异探针作Southern印迹，以化学染色(BICP/NBT)显示。
结 果
1.nested RT-PCR检测BDV ORFⅠ前部片段的方法学试验及灵敏度：以10fg/μl至10
0pg/μl呈10倍级差的不同浓度BDV标准品作方法学检测(图1)。结果表明实验方法准确可靠，
BDV ORFⅠ的最低检测浓度为100fg/μl。
2.人体PBMC中BDV ORFⅠ基因前部片段的检测：对12例经p23检测证实存在BDV感染
的人体PBMC中进行ORFⅠ基因前部片段的检测。结果表明，所有待测样本检测全部呈阴性结
果。
图1 Nested RT-PCR检测BDV p40基因片段电泳图
Fig 1. Electrophoresis of BDV p40 gene fragment
checked by nested RT-PCR
(1-5：100pg/μl-10fg/&mu上一页 [1] [2] [3] 下一页
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