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脉冲场凝胶电泳分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 |
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后，由于其独特的优越性而立刻成为一种迅速、可靠、准确的细菌流行病学调查方法〔1〕。
我们用PFGE对38株临床分离的MRSA进行分型，经限制性内切酶SmaⅠ消化的MRSA染色体
DNA在脉冲场中电泳后，分析其酶切图谱，确定菌株的亲缘关系，从而了解MRSA在北京协和
医院及其它医院间的流行情况。
材料与方法
1.试验菌株：1995年4月-1996年3月自32位住院病人临床标本中分离到38株MRSA。
其中北京协和医院35株，北京东直门外医院、北京朝阳医院和解放军301医院各1株。标本
分离部位分别为痰50%，引流液13%，伤口脓液10%，阴道8%，血5%，其它14%。鉴定方法
采用葡萄球菌凝固酶和葡萄球菌A蛋白凝集试剂盒(法国梅里埃公司)，用含NaCl 4μg/ml和
苯唑青霉素(Oxacillin)6μg/ml的Meuller-Hinton(MH)琼脂碟筛选耐甲氧西林株。
2.抗生素敏感性试验：琼脂稀释法测定MRSA对苯唑青霉素(Oxacillin,OX)，氧氟沙
星(Ofloxacin,OF)、红霉素(Erythromycin,E)、甲氧苄啶(Trimethoprim,T)、
庆大霉素(Gentamicin,G)、壁霉素(Teicomycin,Tei)、利复平(Rifampin,R)、
万古霉素(Vancomycin,V)、磺胺甲基异 唑(Sulfamethoxazole,S)和磷霉素(Ph
osphonomycin,P)的最小抑菌浓度。
3.PFGE
(1)染色体DNA的制备：在MH琼脂碟上挑取单个MRSA菌落种于5ml脑心浸液肉汤中，3
7℃振荡，过夜孵育。取0.5ml菌液于eppenddrof管中，8000r/min离心3分钟，弃上
清，加入TEN液(0.1mol/L Tris pH7.5,0.15mol/L NaCl, 1mol/L EDTA pH8.0)离心，
弃上清，加入0.3ml EC液〔6mmol/L TrisCl pH7.6,1mol/L NaCl,0.1mol/L EDT
A pH7.5,0.2%脱氧胆酸，0.5% Sarkosyl(Sigma公司)〕，保温于50～60℃，加入1%
EC液溶解的低熔点琼脂及10μl Lysostaphin(2μg/ml,Sigma公司)。混匀后倒入模子(1
0×5×1.5mm)中，置于4℃ 15分钟。取出凝胶块加入含15μl Lysostaphin的3ml EC
液中，37℃ 1.5小时溶解细胞壁。弃去EC液，加入3ml ESP液〔0.5mol/L EDTA pH8.0,
1% Sarkosyl,0.5μg proteinase K(Sigma公司)〕50℃过夜。弃去ESP液，加入3m
l TE液和50mmol PMSF,室温放置2小时，重复3次后取出凝胶块置于TE液中4℃保存。
(2)酶切及电泳：首先将凝胶块放于50ml TEN透析液(10mmol/L TrisCl pH8.0,1m
mol/L EDTA,20mmol/L KCl)中室温透析过夜。取出块切下2mm宽小条，置于100μl S
maⅠ酶切缓冲液中4℃平衡30分钟，加入25U的SmaⅠ酶切过夜，140r/min振荡。电泳缓
冲液0.5 TBE液，1%PFGE琼脂倒成凝胶板，CHEF Mapper XA Pulsed Field电泳仪(Bio
rad分司)中进行电泳，6V/cm,角度120。，温度14℃，20小时，脉冲时间5～45秒〔2～
4〕。
(3)PFGE图谱的分型标准：酶切图谱差异3个条带以上者为不同的类型，3 条以下者为同
一型的不同亚型。暴发流行株的图谱定为A型，其余依次按照菌株分离时间命名为B型，C型。
同一型的各亚型间认为在基因上有相关性 ，而不同型的菌株认为在流行病学上无相关性〔5〕。
结 果
1.PFGE谱分析：经SmaⅠ酶切的MRSA的染色体DNA在脉冲场中电泳后，产生10～70
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